一种TTV多亚型检测的组合物及其检测方法

本发明涉及微生物检测的，尤其是一种用于ttv多亚型检测的引物和探针组合物、试剂盒及其非诊断性检测方法。

背景技术：

1、torquetenovirus(ttv)于1997年由日本研究人员在一例不明原因的急性输血后肝炎患者的血液中发现，该患者在手术过程中输入了大量的血液，随后在术后的第9-11周观察到丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，alt)水平升高，通过使用患者血清进行聚合酶链式反应检测发现了一种以前未知的含有dna的病毒，以该患者的名字首字母命名为tt病毒。2009年，国际病毒分类委员会(internationalcommitteeontaxonomyofviruses，ictv)认为其传播途径仅通过输血传播(transfusiontransmission)，经常在不同病毒性肝炎患者中被检测到，后来在多种样品中都检测到该病毒，其传播方式多样，包括唾液微滴和性接触都可能传播该病毒。ictv对ttv的分类命名也有多次变更，2009年，ictv根据病毒的形态特征归类为alphatorquevirusgenus。ttv的基因组的序列多样性水平极高，被划分为多个亚型，截止到2022年公开的亚型包括ttv-1至ttv-31(中间有部分编号被合并，例如原ttv-28被合并为ttv-29)，被单独分类命名的亚型为22个。尽管ttv目前还没有被确认为一种致病病毒，但是，国内献血员阳性率报道为11％～15％，无症状ttv携带者较多，自然人群中ttv阳性率较高，呈现全球分布，可见ttv对人类健康的影响仍然需要更多的研究来确定。

2、ttv是一种无包膜、单链环状的dna病毒，基因组大小为3.6～3.8kb，有至少四个重叠的开放阅读框以及一个高变区(hvr)和一个n-末端精氨酸片段。虽然ttv在人体内扮演的角色仍未确定，但值得肯定的是，ttv病毒载量的大小与人体免疫系统的强弱有直接关系。综合来看，ttv是一个具有多学科(比如基础学科和临床等)交叉研究价值的研究对象，需要运用不同学科的知识和技术共同合作来深入研究和探究。

3、近年来，对ttv病毒的分子遗传结构有了很好的进展，已经开发了多种检测ttv的方法，包括elisa、pcr、rt-pcr、实时pcr、电子显微镜等技术，一方面由于ttv基因组的高度多样性和变异性，不同基因亚型抗体间存在交叉反应，或因为感染时间较短尚未产生抗体造成elisa无法检出；另一方面由于不同基因型之间的变异程度最高可达到50％以上，或者有些核酸阳性者因病毒量较少，已经报道的大部分核酸检测方法中，受限于引物设计位点的问题，常常存在检测范围不广或者检测方法灵敏度不够等问题。常见的几种ttv检测方法的优缺点分析如下：1)elisa检测方法，方法简便，结果的稳定性和重复性好，适用于大规模血清流行病学调查，但是依赖于刺激机体免疫系统发生免疫应答而产生抗体，特异性通常在98～100％之间、灵敏度下限一般为103拷贝/ml；2)传统的nested-pcr检测方法，需要经过电泳方法的验证，对于目的条带相近的序列，很难区分阴性还是阳性，检测的灵敏度下限一般为103-104拷贝/μl；3)real-time实时荧光定量的检测方法，检测限优于传统的pcr检测方法，具有很高的敏感性和特异性，特别适合大量样本的检测，检测的灵敏度下限可以达到102拷贝/ml甚至更低的水平。

4、常见的检测方法均只针对部分ttv亚型进行检测，由于ttv具有高变性的特点，pcr类核酸检测方法也受限于引物设计位点的问题，无法覆盖大多数的亚型，且检测方法灵敏度不够，也容易出现漏检等问题。目前还没有广谱、便捷、高效和灵敏度高的ttv检测方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于至少部分地克服现有技术的缺陷，提供一种广谱用于ttv多亚型检测的引物和探针组合物，

2、为达到上述目的，本发明提供了一种引物和探针组合物，用于ttv多亚型检测，该引物和探针组合物包括引物ttv-f和ttv-r，探针ttv-p，其中ttv-f、ttv-r和ttv-p分别具有如序列表seq id no.1-3所示的核苷酸序列，所述探针ttv-p的5’端标记fam荧光基团，3’端标记bhq1淬灭基团。

3、本发明提供了一种ttv多亚型检测方法，使用引物ttv-f、ttv-r和探针ttv-p进行实时荧光定量pcr检测反应。

4、在本发明应用较佳的实施方式中，该ttv多亚型检测方法的检测步骤为：1)待测样本采集与预处理；2)提取dna；3)制备25μl的反应体系：2×pcr预混液12.5μl，10μm引物ttv-f、ttv-r各0.30～1.0μl、10μm探针ttv-p0.30～1.0μl、dna模板2μl、补充去离子水至25μl；4)实时荧光定量pcr扩增程序：95℃预变性30s；95℃变性5s，56～60℃退火延伸30s，42个循环；5)检测结果与报告。

5、在本发明应用较佳的实施方式中，ttv多亚型检测方法中，dna模板是待测样本dna、阳性质控品或者阴性质控品；该阳性质控品终浓度为102拷贝/μl的ttv标准物质；该阴性质控品可以是去离子水、双蒸水、三蒸水、超纯水或者depc水，优选为去离子水。

6、在本发明应用较佳的实施方式中，ttv多亚型检测方法中，10μm引物ttv-f、ttv-r的用量为0.30～1.0μl、10μm探针ttv-p0.30～1.0μl。

7、在本发明应用较佳的实施方式中，ttv多亚型检测方法中，退火延伸为60℃。

8、本发明提供了一种ttv多亚型检测试剂盒，包含引物ttv-f、ttv-r和探针ttv-p、反应体系所需溶液、阳性质控品、阴性质控品和说明书。

9、在本发明应用较佳的实施方式中，ttv多亚型检测试剂盒中，引物ttv-f、ttv-r和探针ttv-p的浓度均为10μm，反应体系所需溶液含pcrbuffer、dna聚合酶、dntp、mg2+，阳性质控品终浓度为102拷贝/μl的标准物质，阴性质控品为去离子水。

10、在本发明应用较佳的实施方式中，ttv多亚型检测试剂盒中，说明书公开的使用方式包括25μl的pcr反应体系和pcr扩增程序；其中，每个pcr反应体系用量为：pcr预混液12.5μl、引物ttv-f、ttv-r和探针ttv-p各0.50μl、去离子水9μl、dna模板2μl；pcr扩增程序为95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火延伸30s，42个循环。

11、本发明提供了一种用于ttv多亚型检测的引物和探针组合物、ttv多亚型检测方法、ttv多亚型检测试剂盒，在ttv多亚型检测中的应用。

12、本发明的有益效果：

13、本发明提供了一种用于ttv多亚型检测的、广谱的引物和tagman探针组合物，优选real-time实时荧光定量pcr扩增方法，其中引物和探针的序列基于ttv的utr区域进行设计，最终能够通过1个pcr反应检测出样本中是否含有已知的22种亚型的ttv，具有广谱、准确、灵敏等优点。

14、本发明还优化了所述ttv多亚型的检测方法，从研发引物设计开始，打破了高变性ttv广谱型引物设计位点的限制，出乎预料地从utr区域特有的基因序列中筛选出本发明所述的引物和探针组合物，进一步通过对real-time实时荧光定量pcr的反应体系和反应条件的层层优化，有效提高了本发所述ttv多亚型检测方法的灵敏性、特异性及亚型检测的覆盖范围。

15、本发明所述ttv多亚型的检测方法中，pcr扩增程序优化选用二温度点法，即除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，优化设定退火延伸温度为60℃、反应时间为30s，整个pcr反应时间控制在60分钟以内(根据pcr仪升降温速度的不同，时间约40-60分钟)完成，不仅有效缩短了检测时间，而且一管多亚型检测还能够降低检测成本，为对ttv序列多样性的深入研究等课题，提高了阳性样本初筛的效率和研究基础。

16、本发明提供的ttv多亚型检测用引物和探针组合物、检测方法、试剂盒及其应用，不仅能准确、特异地检测出目前已知22种亚型的ttv，在浓度低至1×101拷贝/μl依然能检测出，灵敏度很高，而且与序列测序分析验证的阳性符合率为100％、降低了漏检的几率；应用该检测方法能提高检测的准确性、灵敏度，而且克服了常规检测方法中存在的检测范围覆盖度不广，检测灵敏度不够等问题。