鉴定稻瘟病抗性基因Pi64的SNP分子标记、方法及其应用

本发明涉及分子生物学，具体涉及一种鉴定稻瘟病抗性基因pi64的snp分子标记、方法及其应用。

背景技术：

1、水稻是世界上非常重要的粮食作物之一。由稻瘟菌(magnap rthe grisea)引发的水稻稻瘟病是迄今为止世界上最具有杀伤力的水稻病害，全世界因水稻稻瘟病造成的水稻每年平均减少产量约10％-30％，严重时达40％-50％，更甚的是颗粒无收。到今天为止，这种病在生产上还不能完全得到适当的控制，伴随着温室效应加剧全球气候开始变暖，水稻稻瘟病害的爆发向不可收拾的趋势发展，数据结果表明：2010年稻瘟病发病面积达6000km2，2014年是中国稻瘟病发病最严重的一年，高达58000km2；2019年发病面积达3333km2。

2、因此有效预防水稻稻瘟病的发生，把稻瘟病造成的损失降到最低是水稻生产最重要任务之一，因此筛选抗稻瘟病的优良品种非常重要。目前关于稻瘟病抗性品种的筛选主要是进行人工接种鉴定或自然诱发鉴定，方法原始，机制不够明确，人工接种的方法进行稻瘟病抗性鉴定，鉴定的周期比较长，病原菌生理小种滞后，利用自然诱发鉴定方法又存在病原菌分布不均匀，年度间抗性差异大等问题。所以利用分子标记辅助选择的方法提高品种的稻瘟病抗性有重要的应用价值。

3、目前研究人员已经克隆多个水稻抗稻瘟病基因，如pizt,pi9,pigm,pi2,pik,pi21,pi54等。稻瘟病抗性基因的克隆为稻瘟病的分子标记辅助育种提供了重要的基础，促进了稻瘟病抗性品种的培育从基于人工表型鉴定的传统育种方法到基于分子标记辅助选择的分子育种方法的过渡。

4、稻瘟病在水稻上的发病表现不是单一症状，它有多种类型，根据为害时期和发病部位的不同分为苗瘟、叶瘟、节瘟、穗颈瘟和谷粒瘟等,以叶瘟和穗颈瘟较为常见。已报道的抗稻瘟病基因中，大多数抗病基因为抗叶瘟的基因，而抗穗颈瘟的基因比较少。目前已克隆的抗稻瘟病基因有3个抗性基因有穗颈瘟的抗性pi64,pb1和pi25。pi64是一个同时有叶瘟和穗颈瘟病抗性广谱抗性基因，该基因位于水稻第1号染色体长臂的pi64/pish基因簇，编码一个典型的cc-nbs-lrr类抗性蛋白(ma j,lei c,xu x,hao k,wang j,cheng z,ma x,maj,zhou k,zhang x,guo x,wu f,lin q,wang c,zhai h,wang h,wan j.pi64,encoding anovel cc-nbs-lrr protein,confers resistance to leaf and neck blast inrice.mol plant microbe interact.2015may；28(5):558-68)，将该基因应用于水稻育种中的报道较少。

5、目前，已报道有鉴定pi64的indel标记yrt4、yrt5、yrt6(ma et al,2015)，但是该标记有以下缺点：1)需要同时利用yrt4、yrt5、yrt6三个indel标记才能准确鉴定pi64基因型，过程比较复杂；2)yrt4、yrt5、yrt6是indel标记，需要利用凝胶电泳的方法来检测多态，适合少量样品的分子标记分析，不适合大量样品的自动化高通量检测。

6、开发适合pi64抗性基因鉴定的更加简单和准确并适合大量样品自动化检测的分子标记将有助于将该基因应用于分子标记辅助育种中，加快优良水稻品种的选育进程，对稻瘟病害的防控和保障稻农增产增收方面、粮食安全方面有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对上述问题，提供一种鉴定稻瘟病抗性基因pi64的snp分子标记、方法及其应用。

2、本发明为了实现其目的，采用的技术方案是：

3、本发明的第一方面是提供一种用于鉴定稻瘟病抗性基因pi64的snp分子标记，所述snp分子标记的snp位点在chr01:33101968，snp标记的多态性为a/g，物理位置参考日本晴基因组版本irgsp1.0。

4、所述snp分子标记的多态性位点为seq id no.1所示序列的第2102位核苷酸。

5、所述snp分子标记采用kasp标记引物扩增得到，所述kasp标记引物组包括2条位点特异引物pi64-ra、pi64-rc和1条共用引物pi64-f，引物序列为：pi64-ra(seq id no.4)：5’-gcttttgcacgaaaaatccatt-3’，pi64-rc(seq id no.5)：5’-gcttttgcacgaaaaatccatc-3’，pi64-f(seq id no.6)：5’-gctgctctgcctcaaattcc-3’。

6、所述引物pi64-ra、pi64-rc的5’端或者3’端添加有不同的荧光修饰基团，优选pi64-ra的5’端添加fam标签序列，pi64-rc的5’端添加hex标签序列。

7、本发明的第二方面是提供用于鉴定前述的分子标记的kasp标记引物，包括2条位点特异引物pi64-ra、pi64-rc和1条共用引物pi64-f，引物序列为：

8、pi64-ra：5’-gcttttgcacgaaaaatccatt-3’，

9、pi64-rc：5’-gcttttgcacgaaaaatccatc-3’，

10、pi64-f：5’-gctgctctgcctcaaattcc-3’；

11、优选所述引物pi64-ra、pi64-rc的5’端或者3’端连接有不同的荧光标签序列，优选pi64-ra的5’端添加fam标签序列，pi64-rc的5’端添加hex标签序列。

12、本发明的第三方面是提供上述的snp分子标记或者上述的kasp标记引物在鉴定或者辅助鉴定水稻稻瘟病抗性基因pi64中的应用或者在水稻分子标记辅助育种中的应用。

13、本发明的第四方面是提供一种鉴定水稻稻瘟病抗性基因pi64的方法，包括如下步骤：

14、1)提取待测植株的基因组dna；

15、2)以待测植株的基因组dna为模板，采用上述的kasp标记引物组进行pcr扩增检测上述snp分子标记位点的多态性；

16、3)根据检测到的snp分子标记位点的基因型，判断待测植株是否为具有稻瘟病抗性基因pi64的水稻。

17、优选地，所述pcr扩增反应的反应体系为：总体积10ul的体系：含1.0ul 10×parmsbuffer，1.0ul dntp，kasp引物组的3条引物每条各1.0ul，每条引物的浓度为4mol·l-1，0.2ul parms pcr酶，30～50ng/ul的模板dna 1.0ul，3.8ul ddh2o；

18、pcr反应程序为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃45s，35个循环；最后72℃延伸10min。

19、在上述方法技术方案中，如果检测出待测植株的上述的snp分子标记基因型为a/a，表明待测植株为具有纯合抗病基因pi64/pi64的水稻；如果检测出基因型为g/g，表明待测植株为具有纯合感病基因pi64/pi64的水稻；如果检测出基因型为g/a，表明待测植株为具有杂合基因型pi64/pi64的水稻。

20、优选地，在上述方法技术方案中，所述引物pi64-ra的5’端添加fam标签序列，pi64-rc的5’端添加hex标签序列；如果仅检测到hex荧光信号，表明待测植株的该snp分子标记的基因型为g/g；如果仅检测到fam荧光信号，表明待测植株检的该snp分子标记的基因型为a/a；如果检测到fam和hex两种荧光信号，表明待测植株的该snp分子标记的基因型为g/a。

21、本发明的有益效果是：稻瘟病是水稻生产中的第一大病害，对稻瘟病害的防控在保障粮食安全和稻农增产增收方面有重要意义，而培育聚合多个稻瘟病抗性基因的优良品种是防控稻瘟病害的重要手段。本发明鉴定的pi64抗性基因特异snp位点和相应的kasp标记为pi64抗性基因的鉴定奠定了基础，能够快速检测出水稻种质中的pi64抗性基因，适合大量样品快速、自动化检测，为加快水稻抗稻瘟病新品种选育和改良打下了基础，在水稻育种中有重要应用价值。