一种促进番茄果实成熟的基因及其方法

本发明属于生物工程，涉及到一种调控番茄果实成熟的基因及其方法，特别涉及一种ap2/erf家族转录因子slerf.d3，该基因在调控番茄果实成熟中的应用。

背景技术：

1、番茄（ solanum lycopersicum），又名西红柿，是世界第二大蔬菜作物，也是我国广泛种植的经济作物之一，不仅酸甜可口，而且营养价值丰富。番茄富含维生素a、维生素c、番茄红素以及多酚类物质，可以防衰老、防癌、抗辐射，因此成为人们生活中不可或缺的食品之一，是淡季生长销售中经济效益较高的蔬菜之一。但番茄果皮较薄、水分含量大，在运输及贮藏过程中容易遭受机械损伤以及微生物的侵染，导致番茄的货架周期变短，因此研究番茄的生长及成熟衰老的调控机制对于延长货架期仍是当今的研究重点。番茄为自花授粉植物，兼具生长周期短以及基因组测序完成等特点，所以番茄常作为研究果实生长、成熟衰老的模式作物。

2、早熟番茄由于生长周期短，可以提早上市，有效缓解由于果蔬菜季节性生产而带来的需求问题，延长供应期，具有较好的销售前景和经济效益。同时由于生长周期变短，可相应减少病虫害对果实的侵袭，提高产品的质量。因此找寻一种可以促进番茄早熟的转录因子对于未来提高番茄的经济效益和产品质量具有重要的意义。

3、ap2/erf转录因子作为植物体内最大的转录因子家族之一，曾被人们认为是植物界特有的一类转录因子，具有重要的调节功能。ap2/erf转录因子可以通过响应乙烯信号参与果实的发育过程、调控果实的颜色及风味变化等调控果实成熟；可以通过某些激素信号通路参与病虫害信号的传导，促进相应抗性基因的表达。鉴于该类转录因子的重要调控功能，在番茄中寻找新的erf转录因子仍然是园艺领域的重要任务。

4、在水稻中过表达ap2/erf家族转录因子osrph1导致水稻株高、节间和叶鞘长度降低，表明该转录因子负调控植株的生长。玉米ap2基因sid1和ids1可以对花序分生组织和小穗分生组织进行调控（chunk g,meeley r,hake s.2008,development,135(18):3013-3019）。在植物体中，作为生物反应原料以及提供反应环境的水分，在平衡条件之下参与多种生理调节过程，如光合作用、蒸腾以及呼吸作用等，因此水分平衡对植物生长起着至关重要的作用，若发生水分胁迫，将严格限制植物的生长。有研究表明，ap2/erf转录因子在抵抗水分胁迫中发挥重要调节作用，如zmere180可以增强不定根的形成和提高抗氧化剂的水平延长玉米在水分胁迫下的生长期（yu f,liang k,fang t,et al.2019,plant biotechnolj,17(12):2286-2298）。但是在番茄中对于ap2/erf家族转录因子可以调控果实成熟衰老的研究还鲜有报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种促进番茄果实成熟的基因及其方法。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种促进番茄果实成熟的基因，所述进番茄果实成熟的基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

3、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种促进番茄果实成熟的方法，包括下列步骤：

4、步骤1：grna靶点接头引物的制备；

5、步骤2：grna表达盒构建：配制包含步骤1中靶点接头引物的酶切连接反应液，采用边切边连法使靶点接头与grna表达盒连接，扩展grna表达盒；

6、步骤3：以步骤2的产物为模板，进行第一轮pcr扩增；再以第一轮pcr产物为模板进行第二轮pcr扩增，利用琼脂糖凝胶电泳检测产物浓度，随后对第二轮pcr产物使用dna纯化试剂盒进行纯化回收；

7、步骤4：采用边切边连的方法对步骤3的纯化产物与crispr-cas9质粒进行连接，获得连接好的质粒；

8、步骤5：将步骤4连接好的质粒转化大肠杆菌dh5α感受态细胞；

9、步骤6：挑取步骤5获得的阳性单克隆菌落进行pcr鉴定，对所得的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，获得 slerf.d3-crispr-cas9质粒；

10、步骤7：将 slerf.d3-crispr-cas9质粒转化eha105农杆菌感受态细胞，获得构建好的slerf.d3-crispr-cas9载体的农杆菌单菌落；

11、步骤8：将构建好的slerf.d3-crispr-cas9载体的农杆菌单菌落对番茄进行遗传转化。

12、优选的技术方案为：grna靶点引物接头的制备是先将靶点接头引物溶解成100µm的母液，再分别将靶点一正向引物-f1和r1引物和靶点一反向引物-r1混合稀释到1 µm得到第一混合引物，靶点二正向引物-f2和靶点二反向引物-r2混合稀释到1 µm得到第二混合引物；80-100℃ 30s，随后转移至室温冷却完成退火；

13、靶点接头引物的核苷酸序列如下：

14、靶点一正向引物-f1：5’-gtcacagcagcaaccaaggcttac-3’；

15、靶点一反向引物-r1：5’-aaacgtaagccttggttgctgctg-3’；

16、靶点二正向引物-f2：5’-gtcattcttcagcgcctgctgctg-3’；

17、靶点二反向引物-r2：5’-aaaccagcagcaggcgctgaagaa-3’。

18、优选的技术方案为：步骤2中，

19、为确保 bsal酶的活性，先对 bsai的酶活进行检测，反应体系为10µl，其中含有 bsal酶0.5µl、100ngrna-u#载体，10×cutsmart buffer 1µl，ddh2o补充至10µl，pcr程序设置为37℃，15min，随后进行琼脂糖凝胶电泳检查是否切出目标条带；如果切出目标条带，则说明 bsal酶活性好，可以使用；

20、靶点接头与grna表达盒采用边切边连的方法，包括：

21、grna-u#质粒1 µl，第一混合引物0.5 µl， bsai酶0.4 µl，10×cutsmart buffer 1µl，t4 dna ligase 0.1 µl，10×t4 dna ligase buffer 0.5 µl，ddh2o补充至10µl，pcr程序设置为37℃ 5min，20℃ 5min，5个循环，获得第一连接产物；

22、grna-u#质粒1 µl，第二混合引物0.5 µl， bsai0.4 µl, 10×cutsmart buffer 1µl，t4 dna ligase 0.1 µl，10×t4 dna ligase buffer 0.5 µl，ddh2o补充至10µl，pcr程序设置为37℃ 5min，20℃ 5min，5个循环，获得第二连接产物。

23、优选的技术方案为：步骤3中，

24、每个grna表达盒含2轮pcr反应，在第一轮轮pcr中，共含4个反应，反应总体系为50μl；

25、靶点一的反应一为：取1 μl第一连接产物为模板，2 µl u-f，2 µl 靶点一反向引物-r1，1 µl super-fidelity dna polymerase，10 µl 5×super-fidelity dnapolymerase buffer，1 µl dntps，ddh2o补充至50µl，获得第三连接产物；

26、靶点一的反应二为：取1 μl第一连接产物为模板，2 µl grna-r，2 µl靶点一正向引物-f1，1 µl super-fidelity dna polymerase，10 µl 5×super-fidelity dnapolymerase buffer，1 µl dntps，ddh2o补充至50µl，获得第四连接产物；

27、靶点二的反应一为：取1 μl第二连接产物为模板，2 µl u-f，2 µl 靶点二反向引物-r1，1 µl super-fidelity dna polymerase，10 µl 5×super-fidelity dnapolymerase buffer，1 µl dntps，ddh2o补充至50µl，获得第五连接产物；

28、靶点二的反应二为：取1 μl第二连接产物为模板，2 µl grna-r，2 µl靶点二正向引物-f1，1 µl super-fidelity dna polymerase，10 µl 5×super-fidelity dnapolymerase buffer，1 µl dntps，ddh2o补充至50µl，获得第六连接产物；

29、pcr程序设置为：95℃预变性1min，95℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸15s，25个循环；最后72℃延伸10min。扩增结束后取5 μl产物用2%琼脂糖胶电泳进行检测；

30、u-f：5’-ctccgttttacctgtggaatcg-3’；

31、grna-r：5’-cggaggaaaattccatccac-3’；

32、进行第二轮pcr反应之前，预先将位置特异引物对混合成10×工作液，每种1.5 µm：引物组合工作液pt1=1.5 µl b1’+1.5 µl b2+7 µlddh2o，引物组合工作液pt2l=1.5 µlb2’+1.5 µl bl+7 µl ddh2o；

33、靶点一反应体系为：第一轮pcr扩增的第三连接产物和第四连接产物各1 µl，3 µl引物组合工作液pt1，0.6 µl的dntps，0.6 µl的super-fidelity dna polymerase，6 µl的5×super-fidelity dna polymerase buffer，17.8 µl的ddh2o混匀后置于pcr仪中，扩增得到第七连接产物；

34、靶点二反应体系为：第一轮pcr扩增的第五连接产物和第六连接产物各1 µl，3 µl引物组合工作液pt2l，0.6 µl的dntps，0.6 µl的super-fidelity dna polymerase，6 µl的5×super-fidelity dna polymerasebuffer，17.8 µl的ddh2o混匀后置于pcr仪中，扩增得到第八连接产物；

35、pcr反应条件为：95℃，1 min；95℃，10s，60℃，15s，72℃，15 s，18个循环；72℃，10min；4℃，∞；

36、b1’：5’-ttcagaggtctctctcgactagtggaatcggcagcaaagg-3’；

37、b2：5’-agcgtgggtctcgtcagggtccatccactccaagctc-3；

38、b2’：5’-ttcagaggtctctctgacactggaatcggcagcaaagg-3；

39、bl：5’-agcgtgggtctcgaccgacgcgtccatccactccaagctc-3。

40、优选的技术方案为：步骤4中，

41、使用边切边连的方法进行pcr反应；反应体系为：步骤3的纯化产物0.2µl，crispr-cas9质粒1µl， bsal酶0.5µl，10×bsai buffer 1.5µl，ddh2o 11.8µl，37 ℃酶切10min；加10 x neb t4dna ligase buffer 0.4 µl，t4dna ligase 0.1µl，在pcr仪中设置37℃ 2min，10℃ 3 min，20℃ 5 min，13个循环，最后37℃ 2 min，获得连接好的质粒；步骤3的纯化产物是指第七连接产物和第八连接产物按照1:1的提及比例混合后再进行纯化后获得的产物。

42、优选的技术方案为：步骤5中，取5µl连接好的质粒转入50µl大肠杆菌dh5α感受态细胞中，用手拨打离心管底部使其均匀，冰浴25min，42℃热激45s，冰浴2min；向其中加入350µl液体lb培养基，于37℃、200rmp的摇床中摇菌1 h；对培养得到的菌液进行6000rmp离心1min，留取100µl上清，将菌液吹吸混匀后涂布于含有卡那霉素的固体lb中，倒置于37℃培养箱过夜培养。

43、优选的技术方案为：步骤6中，鉴定体系为25µl：其中，步骤5获得的菌液2µl，sp-l/sp-r引物各1µl，2×taq酶12.5µl，ddh2o 8.5µl；pcr仪中进行反应的条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸15s，共35个循环，72℃后延伸5min；待pcr反应结束后，取8µl样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，看电泳条带大小是否符合理论值，将条带正确的菌液转移至3ml含卡那霉素的液体lb中进行扩大培养，37℃、200rmp振荡培养16 h，使用质粒提取试剂盒提取质粒并跑琼脂糖凝胶电泳检测，对提取的质粒进行进一步测序，获得 slerf.d3-crispr-cas9质粒；

44、sp-l序列：gtcgtgctccacatgttg；

45、sp-r序列：cccgacatagatgcaataacttc。

46、优选的技术方案为：步骤7中，取100 µl eha105农杆菌感受态细胞，将其分为两管，在冰浴中待其融化，加入1µl slerf.d3-crispr-cas9质粒，用手拨打离心管底部使其混匀，依次在冰上静置5 min、液氮5 min、37℃水浴5 min、冰浴5 min；加入700 µl无抗生素的lb液体培养基，于28℃振荡培养2-3h；5000 rpm 离心5 min收菌，留取200 µl左右上清，重悬菌体，涂布于lb-kana/rif固体培养基上，倒置于28℃培养箱培养2-3天，获得构建好的slerf.d3-crispr-cas9载体的农杆菌单菌落。

47、优选的技术方案为：步骤8中，将构建好的slerf.d3-crispr-cas9载体的农杆菌单菌落，溶于10µl无菌水中制成菌液，将菌液加入3 ml含kana和rif的液体lb培养基中，200rpm，28℃培养过夜，随后取400 µl于30 ml含kana和rif的液体lb培养基中，200 rpm，28℃震荡培养6-7 h，用分光光度计检测，直到菌液od600为0.6-0.8，5000 rpm室温离心5 min收集菌体，弃上清，用无菌水吹吸菌体沉淀至od600为0.1-0.15；将番茄子叶和茎段黑暗预培养2 d后浸泡于稀释好的农杆菌侵染液中，侵染5 min后倒掉侵染液，将子叶和茎段分别置于含不同植物激素的培养基上发芽、芽伸长、生根，将生根的外植体转移至营养土中培养，并进行后续测序鉴定，进而得到转化的番茄植株。随后设计靶点上下游引物，提取番茄植株dna，以番茄dna为模板进行pcr扩增，通过测序鉴定，分析 slerf.d3基因是否发生编辑。

48、由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

49、本发明从番茄中获得slerf.d3基因的编码序列，设计了crispr-cas9载体的引物，并构建了相应载体，借助农杆菌感受态细胞成功侵染番茄，获得了番茄的slerf.d3-crispr-cas9的基因编辑植株，发现与野生型番茄植株相比，slerf.d3-crispr-cas9植株的果实表现出明显的早熟现象，结果表明slerf.d3基因可以调控番茄果实的成熟衰老进程。