用于区分鼻咽癌和鼻型NK/T细胞淋巴瘤的诊断标志物及其应用

本发明属于生物医药，具体涉及用于区分鼻咽癌和鼻型nk/t细胞淋巴瘤的诊断标志物及其应用。

背景技术：

1、鼻咽癌又被称为广东癌，高发于中国的华南地区。目前，临床上主要通过鼻咽镜、影像扫描(如ct、mri等)、组织活检等方式进行鼻咽癌的诊断。但早期鼻咽癌的症状不明显且不具有特异性(如鼻涕血、喉咙疼痛、吞咽困难、头疼、耳鸣或疼痛等)，常常被患者忽视，进而导致大部分患者确诊时已经进展到晚期，极大的影响了患者的预后。因此，在高发区开展便捷、有效的早筛工作对提高鼻咽癌早诊率、改善患者预后具有非常重要的意义。

2、鼻型nk/t细胞淋巴瘤是增长迅速的一种非霍奇金淋巴瘤，常见于亚洲。这种淋巴瘤通常发生在淋巴结以外的器官或组织中，最常见的于鼻腔中，也会影响鼻窦或喉咙的上部。该病的患者最常见的首发症状是鼻塞、流涕、涕血，其次是水肿和溃疡性坏死病变，主要影响鼻腔粘膜、鼻中隔、鼻副窦和鼻咽。临床上通常采取影像学、病理活检等方式进行诊断。

3、由于鼻咽癌起源于鼻咽部，因此对于鼻咽部的无创，高效取材及相应分子标志物的检测能更为直接反应病变部位的状况，理论上能及时发现早期原发或复发的鼻咽癌患者。通过鼻咽拭子刷取鼻咽部样本是可行的技术方案，既往已经在中国华南地区，印度尼西亚，加拿大等国家或地区开展了相应研究，即利用鼻咽刷或鼻咽拭子对鼻咽部可疑部位刷取取样，随后通过对eb病毒dna载量进行q-pcr的检测，来判断是否患有鼻咽癌。由于鼻咽拭子是可以直接获取鼻咽部病变部位的样本而采用的方法，不仅具有无痛、无侵袭性的优点，而且获取的脱落细胞可以直接反映鼻咽部肿瘤的特性，因此在鼻咽癌的早筛早诊中得到广泛关注。

4、但是无论是鼻咽癌还是鼻型nk/t细胞淋巴瘤的发生发展，都与eb病毒的感染密切相关。同时由于发病部位相同，且临床表现等存在相似之处，因此仅通过鼻咽拭子取样检测eb病毒载量难以区分这两种疾病。

5、尽管致病的确切机制尚不清楚，但目前有研究发现在不同的eb病毒相关肿瘤中，eb病毒的甲基化模式存在差异，提示可以从eb病毒的甲基化角度对鼻咽癌和鼻型nk/t细胞淋巴瘤进行鉴别诊断。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种可有效区分鼻咽癌和鼻型nk/t细胞淋巴瘤、诊断鼻咽癌的生物标志物。

2、本发明所采取的技术方案是：

3、本发明的第一方面，提供一种甲基化生物标志物组合，所述甲基化生物标志物包括eb病毒bilf2基因片段中的全部或部分cpg位点。

4、优选地，所述甲基化生物标志物包括eb病毒(nc_007605.1)bilf2基因片段上137999bp、138017bp、138035bp、138059bp、138073bp、138083bp、138088bp、138096bp、138113bp、138149bp中的任意一个或多个cpg位点。

5、优选地，所述甲基化生物标志物包括eb病毒bilf2基因片段上138035bp、138059bp、138073bp和138149bp的cpg位点。

6、优选地，所述bilf2基因片段为nc_007605.1:137464-138282。

7、本发明的第二方面，提供检测本发明第一方面所述标志物甲基化水平的试剂在制备产品中的应用，所述产品的功能为如下任一种；

8、(1)诊断鼻咽癌；

9、(2)区分鼻咽癌和鼻型nk/t细胞淋巴瘤。

10、优选地，所述检测所述标志物甲基化水平的试剂包括通过甲基化特异性pcr、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字pcr法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法中的至少一种方法检测标志物甲基化水平的试剂。

11、优选地，所述试剂包括引物、探针。

12、优选地，所述引物的序列包括：

13、甲基化上游引物：tggaagtagttacggttaagg(seq id no.1)；

14、甲基化下游引物：tcaccgcccatacaaatacta(seq id no.2)；

15、非甲基化上游引物：ttggaagtagttatggttaagg(seq id no.3)；

16、非甲基化下游引物：tcaccacccatacaaatactaa(seq id no.4)。

17、优选地，所述探针的序列包括：

18、甲基化探针：attttcgggagtgtattttcggttt(seq id no.5)；

19、非甲基化探针：tatttttgggagtgtatttttggttta(seq id no.6)。

20、优选地，所述探针的两端分别标记有荧光报告基因和荧光淬灭基因。

21、优选地，所述探针5’端标记有荧光报告基因，3’端标记有荧光淬灭基因。

22、优选地，所述荧光报告基因选自fam、hex、rox、cy5、cy3、vic中的至少一种；所述荧光淬灭基因选自bhq1、bhq2、bhq3、mgb中的至少一种。

23、优选地，所述产品包括试剂、试剂盒、试纸、芯片中的至少一种。

24、本发明的第三方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包括用于检测本发明第一方面所述标志物的试剂。

25、优选地，所述试剂盒的功能为如下中的至少一种：

26、(1)诊断鼻咽癌；

27、(2)区分鼻咽癌和鼻型nk/t细胞淋巴瘤。

28、优选地，所述检测所述标志物甲基化水平的试剂包括通过甲基化特异性pcr、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字pcr法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法中的至少一种方法检测标志物甲基化水平的试剂。

29、优选地，所述试剂包括引物、探针。

30、优选地，所述引物的序列包括：

31、甲基化上游引物：tggaagtagttacggttaagg(seq id no.1)；

32、甲基化下游引物：tcaccgcccatacaaatacta(seq id no.2)；

33、非甲基化上游引物：ttggaagtagttatggttaagg(seq id no.3)；

34、非甲基化下游引物：tcaccacccatacaaatactaa(seq id no.4)。

35、优选地，所述探针的序列包括：

36、甲基化探针：attttcgggagtgtattttcggttt(seq id no.5)；

37、非甲基化探针：tatttttgggagtgtatttttggttta(seq id no.6)。

38、优选地，所述产品包括试剂、试剂盒、试纸、芯片中的至少一种。

39、本发明的第四方面，提供一种用于诊断鼻咽癌或区分鼻咽癌和鼻型nk/t细胞淋巴瘤的系统，包括：

40、检测模块，用于检测样本中第一方面所述的标志物的甲基化水平；

41、分析模块：用于获取上述检测结果，根据预定规则判断诊断结果。

42、优选地，所述预定规则具体为：以截断值为界将数据分为高甲基化组和低甲基化组，通过比较所述待测样本的甲基化水平与截断值的相对大小确定所述待测样本是否为鼻咽癌，若甲基化水平大于截断值，则诊断为鼻咽癌；若甲基化水平低于截断值，则诊断为鼻型nk/t细胞淋巴瘤或非鼻咽癌。

43、优选地，所述样本选自鼻咽拭子、血浆、血清、全血、唾液、组织、细胞样品、尿液、粪便中的至少一种。

44、本发明的有益效果是：

45、本发明通过对鼻咽癌和鼻型nk/t细胞淋巴瘤的样本进行eb病毒甲基化分析，筛选出高灵敏性和特异性的甲基化位点，包括eb病毒bilf2基因片段上137999bp、138017bp、138035bp、138059bp、138073bp、138083bp、138088bp、138096bp、138113bp和138149bp位点；可作为区分鼻咽癌和鼻型nk/t细胞淋巴瘤的诊断标志物；发明人还针对甲基化位点进行了引物、探针设计。通过roc分析发现具有非常高特异性和灵敏性，具有诊断价值，可以用于鼻咽癌和鼻型nk/t细胞淋巴瘤或非鼻咽癌患者的区分，提高鼻咽癌的诊断效率。