一种用于EB病毒核酸检测的crRNA及其应用的制作方法

本技术涉及生物，尤其是涉及一种用于eb病毒核酸检测的crrna及其应用。

背景技术：

1、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，npc)是常见的恶性肿瘤之一，eb病毒(epsteinbarr virus，ebv)的检测是鼻咽癌早期筛查、疾病进展、治疗疗效和预后监测的重要指标。目前临床主要有两种方法检测eb病毒，一是血清学方法检测eb病毒抗体；另一种是荧光定量pcr方法检测ebv dna病毒核酸。相比病毒抗体，病毒核酸检测结果能更稳定地反映eb病毒的感染、复制及其含量情况，因而ebv dna核酸检测已成为鼻咽癌筛查和诊断的重要手段。荧光定量pcr检测是临床eb病毒核酸检测的“金标准”，目前商业化试剂盒的检测敏感度在100-500copies/ml。

2、虽然荧光定量pcr是eb病毒核酸检测的金标准，灵敏度较高，可检测到100-500拷贝，但对于早期感染的患者，该方法的检测灵敏度不够，容易出现假阴性结果而造成漏检；其次，荧光定量pcr是依赖专业仪器和专门培训才能实施，适合于实验室检测，不适于现场检测和社区筛查的快速诊断的要求。因此，研发操作方便、灵敏度更高的eb病毒核酸检测方法是诊断eb病毒及类似病原体的迫切需要，具有重要的临床应用价值。

3、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，rpa)是一种新型的核酸等温扩增技术，在温度为37℃-42℃，10-20min内对核酸进行有效扩增，扩增效率可达数十亿倍。而酶重组扩增(era)技术是rpa的升级版本，与pcr相比，era与rpa温度要求较低，不需要特殊的仪器，反应时间较短，简便、高效、快速，特异性与敏感性高，是可以替代pcr的核酸检测技术。检测era扩增结果有许多检测方法，包括琼脂糖凝胶电泳、实时荧光定量检测、侧向流动试纸条等检测手段。琼脂糖凝胶电泳较复杂，需对扩增产物进行纯化后再行电泳检测，且易产生气溶胶，对环境造成污染。荧光法或试纸条法检测各加入特异性探针，而era探针设计复杂，价格昂贵，不适于推广。

4、crispr/cas基因编辑技术来源于某些细菌和古细菌内的免疫防御系统，经过人工改造可对dna或者rna进行编辑。主要由具有核酸酶功能的cas蛋白和一段特异的引导核酸序列组成，目前主要开发了cas9、cas12、cas13和cas14等crispr/cas系统，其中cas9、cas12和cas14是rna引导的dna核酸酶，而cas13则是rna编辑酶。除了准确的靶向切割目标核酸序列外，cas12、cas13和cas14蛋白还存在“附带切割效应”。当cas12、cas13和cas14蛋白在引导rna引导下与靶dna(cas12靶向双链dsdna；cas14靶向单链ssdna)或者rna序列(cas13靶向rna)通过碱基互补配对特异性地形成双链后即可激活cas蛋白的酶活性，cas酶则可以以一种非特异性的方式切割单链靶dna或者rna分子，即“附带切割”，利用这一特性，将靶dna或者rna分子改造成信号分子后，cas12、cas13和cas14蛋白可以应用于核酸的定量和定性检测，极大提高检测的敏感度。

5、目前还没有研究公开采用酶重组扩增(era)联合crispr/cas12a以检测eb病毒核酸。

技术实现思路

1、本技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种基于酶重组扩增联合crispr/cas12a的eb病毒核酸检测试剂盒及检测方法，本技术利用酶促重组等温扩增技术(era)结合crispr/cas12a基因编辑技术(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats/cas12a)使得eb病毒核酸检测操作简单，灵敏度更高，更适于现场检测和社区筛查的快速诊断。

2、为实现上述目的，本技术采取的技术方案为：

3、第一目的，本技术提供了一种用于eb病毒核酸检测的crrna，所述crrna包括lmp1-crrna1、lmp1-crrna2、lmp1-crrna3、lmp2-crrna1、lmp2-crrna2和lmp2-crrna3中的至少一种，所述lmp1-crrna1的核苷酸序列为seq id no：4；所述lmp1-crrna2的核苷酸序列为seqid no：5；所述lmp1-crrna3的核苷酸序列为seq id no：6；所述lmp2-crrna1的核苷酸序列为seq id no：7；所述lmp2-crrna2的核苷酸序列为seq id no：8；所述lmp2-crrna3的核苷酸序列为seq id no：9。

4、本技术新设计出以上六条crrna，该crrna切割靶序列的效率高，可以特异性识别ebv，可以提高检测的灵敏度和准确度。

5、第二目的，本技术提供了检测上述crrna的引物组，所述引物组的核苷酸序列如seq id no：10～21所示。

6、本技术筛选出检测以上crrna的引物组，可以提高检测crrna的敏感性，使得检测病毒的灵敏度更高。

7、第三目的，本技术提供了上述crrna在制备eb病毒核酸检测产品中的应用。

8、优选地，所述检测产品包括检测试纸条或检测试剂盒。

9、第四目的，本技术提供了一种基于酶重组扩增联合crispr/cas12a的eb病毒核酸检测产品，所述检测试纸条包括上述引物组和crispr/cas12a检测体系；

10、所述crispr/cas12a检测体系包括cas12a蛋白、上述crrna、ssdna报告系统。

11、优选地，所述cas12a蛋白为lbcas12a。所述lbcas12a的浓度为1μm；所述crrna的浓度为5μm。

12、作为本技术所述基于酶重组扩增联合crispr/cas12a的eb病毒核酸检测产品的优选实施方式，所述ssdna报告系统包括含有浓度为0.1～10μm的ssdna探针。优选为所述ssdna探针的浓度为5μm。

13、本技术对lbcas12a、crrna、ssdna探针的浓度进行优选，使得检测eb病毒核酸更为准确，检测敏感性高，特异性强。

14、第五目的，本技术提供了一种非疾病诊断和治疗目的的检测eb病毒核酸的方法，包括以下步骤：

15、(1)取待测样品，提取eb病毒基因组；

16、(2)era酶促重组等温扩增：以上述引物组，扩增步骤(1)中得到的eb病毒基因组；

17、(3)crispr/cas12a检测：取步骤(2)中的扩增产物，加入ssdna探针、cas12a蛋白和上述crrna，进行crispr/cas12a检测，并读取检测信号(试纸条法/荧光法)。试纸条法适合现场检测和社区筛查快速诊断，荧光法适合实验室高通量检查。

18、作为本技术所述检测eb病毒核酸的方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，以5min为梯度，在10min-20min范围内扩增，所述eb病毒基因组的浓度为106copies/μl。

19、作为本技术所述检测eb病毒核酸的方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，所述扩增产物的浓度稀释为102～105copies/μl。

20、第六目的，本技术提供了上述eb病毒核酸检测产品在检测eb病毒核酸中的应用。

21、与现有技术相比，本技术具有以下有益效果：

22、本技术提供了一种用于eb病毒核酸检测的crrna及其应用，本技术基于酶重组扩增联合crispr/cas12a检测eb病毒核酸，本技术的检测方法不需要专业人员及特殊仪器，操作方便，反应时间短(<1小时)，更适于现场检测和社区筛查的快速诊断。相比较于单纯era等温扩增检测，era联合crispr/cas12a检测更灵敏，而且试纸条的操作更简单，不需要电泳。