一种革兰氏阴性杆菌增菌培养基的制作方法

本发明涉及菌群培养，具体为一种革兰氏阴性杆菌增菌培养基。

背景技术：

1、革兰阴性菌泛指革兰氏染色反应呈红色的细菌。在革兰氏染色实验中，首先添加了龙胆紫(crystal violet)，再添入另一种复染染料，通常使用番红(safranin)或品红(fuchsine)，从而将所有的革兰氏阴性菌染成红色或粉色。通过这种测试我们可以区分两种细胞壁结构不同的细菌。革兰氏阳性菌在反应后的除色溶液中将呈现龙胆紫的颜色。

2、无论阳性菌还是阴性菌都有杆菌和球菌。葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌是临床最为常见的病原菌，葡萄球菌属于革兰阳性球菌，大肠杆菌属于革兰阴性菌中的肠杆菌科，除大肠杆菌以外，临床较常见的肠杆菌科细菌还有变形杆菌、沙门氏菌、克雷白杆菌；绿脓杆菌属于假单胞菌，为非发酵菌，是临床常见的较耐药革兰阴性杆菌。

3、革兰氏阴性杆菌在关于医药领域研究中，需要生产质粒dna，对于革兰氏阴性杆菌而言，培养基组分的不同会启动革兰氏阴性杆菌胞内不同的代谢途径。不同于蛋白质，质粒dna是由糖－磷酸骨架和含氮的核苷酸(atgc)组成，主要组成元素是c、h、o、p、n，目前质粒dna生产多采用的是蛋白质工程菌的发酵培养基一般在质粒dna的生产中都采用发酵罐发酵的方法来提高质粒dna总产量，而发酵法通常是通过优化菌的生长情况，提高每升培养基的菌体量来提高质粒dna产量。质粒dna在临床上的应用中，宿主基因组dna、rna、宿主蛋白和内毒素的含量对于质粒dna的转染效率有极大的影响，因此，单纯提高每升培养基的菌体量会对后续的质粒分离和纯化流程带来更大的挑战，为此我们提出一种革兰氏阴性杆菌增菌培养基。

技术实现思路

1、(一)解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了一种革兰氏阴性杆菌增菌培养基，解决了上述问题。

3、(二)技术方案

4、为实现上述所述目的，本发明提供如下技术方案：一种革兰氏阴性杆菌增菌培养基，1l体积的增菌培养基包括以下组分：15～22g蛋白胨、3～5g磷酸氢二钾、0.5～2g葡萄糖、1～3g甘露醇、3～8g氯化钠、0.3～1ml指示剂、5～15g抗氧化剂、0.03～0.15g抗生素、3～7g革兰氏阳性细菌抑制物、0.08～0.12g硫酸镁、0.01～0.1g氯化钙、0.2～0.6g磷酸二氢钠、2～5g氢氧化钠和20～60ml无抑菌性的基液油，其余为水。

5、优选的，所述蛋白胨为胰蛋白胨、鱼粉蛋白胨或大豆蛋白胨中一种。

6、优选的，所述无抑菌性的基液油为橄榄油、芝麻油、葡萄籽油和玉米油中一种或几种。

7、优选的，所述革兰氏阳性细菌抑制物包括玫瑰红、胆盐、胆酸钠、牛胆粉、硫代硫酸钠、万古霉素和柠檬酸钠中一种或几种。

8、优选的，所述抗氧化剂为丙酮酸钠、3,3'-二硫代二丙酸、维生素c或维生素e。

9、优选的，所述抗生素为氨苄青霉素或卡那霉素。

10、优选的，所述增菌培养基的ph值为6.8～7.4。

11、优选的，革兰氏阴性杆菌增菌培养基的制备方法，包括以下步骤：

12、s1：将15～22g蛋白胨、3～5g磷酸氢二钾、0.5～2g葡萄糖、1～3g甘露醇、3～8g氯化钠、0.3～1ml指示剂、5～15g抗氧化剂、3～7g革兰氏阳性细菌抑制物、0.08～0.12g硫酸镁、0.01～0.1g氯化钙、0.2～0.6g磷酸二氢钠、2～5g氢氧化钠和20～60ml无抑菌性的基液油加入水中，且总体积为1l，并将上述混合物进行搅拌加热溶解，高压蒸汽灭菌，温度为110～135℃，灭菌时间为30min，之后自然冷却加入0.03～0.15g抗生素，得到革兰氏阴性杆菌增菌培养基；

13、s2：将革兰氏阴性杆菌菌群接种到步骤s1得到的增菌培养基中，均质1～2min后进行增菌培养。

14、优选的，所述s2中增菌培养的温度为30～40℃，时间为15～25h。

15、(三)有益效果

16、与现有技术相比，本发明提供了一种革兰氏阴性杆菌增菌培养基，具备以下有益效果：

17、1、该革兰氏阴性杆菌增菌培养基，通过优化革兰氏阴性杆菌增菌培养基中各个组分配比，以及通过添加抗氧化剂，其可以中和抗菌和抑菌物质中过氧化物的自由基，抵抗自由基对革兰氏阴性杆菌的损害，促使革兰氏阴性杆菌群有效地增殖和生长从而被检出。

18、2、该革兰氏阴性杆菌增菌培养基，通过使用硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钠和氢氧化钠配合，能够促进菌群自身对于营养物质的吸收以及相关代谢过程的进行，有利于刺激菌群的稳定生长和繁殖；同时硫酸镁为菌群细菌生长提供了丰富的氮源，保证了菌群足够的能量摄取；磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、与氢氧化钠一起组成缓冲体系，为菌群生长提供了稳定的酸碱度。

技术特征：

1.一种革兰氏阴性杆菌增菌培养基，其特征在于，1l体积的增菌培养基包括以下组分：15～22g蛋白胨、3～5g磷酸氢二钾、0.5～2g葡萄糖、1～3g甘露醇、3～8g氯化钠、0.3～1ml指示剂、5～15g抗氧化剂、0.03～0.15g抗生素、3～7g革兰氏阳性细菌抑制物、0.08～0.12g硫酸镁、0.01～0.1g氯化钙、0.2～0.6g磷酸二氢钠、2～5g氢氧化钠和20～60ml无抑菌性的基液油，其余为水。

2.根据权利要求1所述的一种革兰氏阴性杆菌增菌培养基，其特征在于，所述无抑菌性的基液油为橄榄油、芝麻油、葡萄籽油和玉米油中一种或几种。

3.根据权利要求1所述的一种革兰氏阴性杆菌增菌培养基，其特征在于，所述革兰氏阳性细菌抑制物包括玫瑰红、胆盐、胆酸钠、牛胆粉、硫代硫酸钠、万古霉素和柠檬酸钠中一种或几种。

4.根据权利要求1所述的一种革兰氏阴性杆菌增菌培养基，其特征在于，所述抗氧化剂为丙酮酸钠、3,3'-二硫代二丙酸、维生素c或维生素e。

5.根据权利要求1所述的一种革兰氏阴性杆菌增菌培养基，其特征在于，所述抗生素为氨苄青霉素或卡那霉素。

6.根据权利要求1所述的一种革兰氏阴性杆菌增菌培养基，其特征在于，所述增菌培养基的ph值为6.8～7.4。

7.根据权利要求1-6任意一项所述的一种革兰氏阴性杆菌增菌培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求1所述的一种革兰氏阴性杆菌增菌培养基的制备方法，其特征在于，所述s2中增菌培养的温度为30～40℃，时间为15～25h。

技术总结
本发明涉及菌群培养技术领域，且公开了一种革兰氏阴性杆菌增菌培养基，1L体积的增菌培养基包括以下组分：15～22g蛋白胨、3～5g磷酸氢二钾、0.5～2g葡萄糖、1～3g甘露醇、3～8g氯化钠、0.3～1ml指示剂、5～15g抗氧化剂、0.03～0.15g抗生素、3～7g革兰氏阳性细菌抑制物、0.08～0.12g硫酸镁、0.01～0.1g氯化钙、0.2～0.6g磷酸二氢钠、2～5g氢氧化钠和20～60ml无抑菌性的基液油，其余为水，该培养基通过优化革兰氏阴性杆菌增菌培养基中各个组分配比，以及通过添加抗氧化剂，其可以中和抗菌和抑菌物质中过氧化物的自由基，抵抗自由基对革兰氏阴性杆菌的损害，促使革兰氏阴性杆菌群有效地增殖和生长从而被检出。

技术研发人员：宁振兴,张华,祁松,王学彬,安慧,付旭东,东贤,曹航,武侠均,安晓珂
受保护的技术使用者：河北利华药业有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14