一种基于催化发夹自组装和杂交链式反应的多种miRNA同时检测方法

本发明属于生物检测，特别涉及一种基于催化发夹自组装和杂交链式反应的多种mirna同时检测方法。

背景技术：

1、microrna(mirna)是一类内源性的小rna，在细胞发育、分化等生命过程中起着重要的调控作用，其异常表达与多种疾病相关，是预防、诊断、治疗癌症及其它疾病的理想生物标志物。因此，开发具有高灵敏度、高特异性、高稳定性的mirna检测方法或策略对于癌症等重大疾病的诊断具有重要意义。研究者们致力于mirna研究开发了多种有关mirna的检测方法，其中常用检测方法是传统的分子生物学技术，如qrt-pcr、northern印迹、微阵列等。但是，由于仪器昂贵、操作复杂、mirna序列长度短、丰度低、序列同源性大等固有特性，使得上述检测方法对mirna进行定量检测同样具有很大的挑战。因此，开发简单、高效、灵敏的检测方法尤为重要。

2、脱氧核酶作为人工核酸酶家族中的一员，可催化一些化学反应。与蛋白质酶相比，脱氧核酶热稳定性高、易合成、识别区域灵活性高，是开发生物传感平台的理想选择。其中由g-四链体序列和血红素组成的g-四链体/血红素复合体脱氧核酶，表现出较好的过氧化物酶活性，在h2o2存在时可以催化abts、鲁米诺、硫胺等产生颜色变化、化学发光或荧光等现象。因此，基于g-四链体脱氧核酶的优良特性，可开发比色、化学发光或荧光等检测传感平台。化学发光检测法因其灵敏度高、校准范围宽、仪器简单等显著特性，广泛应用于生物标志物的检测。

3、现有的检测方法或生物传感器常致力于研究单一mirna的检测，很少报道可以同时量化检测同一样品中多种mirnas。然而，肿瘤的生理环境及致病机理复杂，单一生物标记物的检测对于病症的准确诊断不具备说服力。在癌症临床诊断领域，若能同时检测多种生物标志物，将可以大大提高癌症诊断的可靠性和准确性。然而，近年来大多数有关mirna的检测研究只关注到高灵敏度等优点，而忽略了高通量、高准确性定位这一特点。

4、因此，鉴于mirna与疾病的复杂相关性，开发能同时对多种mirnas高灵敏检测的平台，是一个需要解决的问题。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的问题，本发明提出了一种基于催化发夹自组装和杂交链式反应的多种mirna同时检测方法。所述的方法将催化发夹自组装和杂交链式反应两种恒温放大手段相结合，借助g-四链体脱氧核酶的类辣根过氧化物酶催化活性，实现对多种mirna的同时可视化化学发光成像检测。

2、本发明的目的是这样实现的：

3、本发明的第一方面提供了一种基于催化发夹自组装和杂交链式反应的多种mirna同时检测方法，包括以下步骤：

4、步骤1，发夹探针检测单元的构建：将不同的发夹探针h1，分别固定在石英阵列检测孔底部，形成若干不同检测单元；

5、步骤2，将含有待测mirna序列和对应不同发夹探针h2的反应溶液，加入到步骤1所述不同检测单元内，该过程发生于催化发夹自组装(cha)，反应后去除多余的待测mirna序列和发夹探针h2；

6、步骤3，将发夹探针h3和发夹探针h4的混合液分别加入到经步骤2处理后的不同检测单元内，该过程发生杂交链式反应(hcr)，反应后洗涤；

7、所述发夹探针h3末端标有3/4的g-四链体序列，发夹探针h4末端标有1/4的g-四链体序列，发生催化发夹自组装反应并形成完整的g-四链体脱氧核酶；

8、步骤4，向步骤3处理后的不同检测单元内加入血红素溶液，反应后再加入鲁米诺和h2o2，立即进行成像检测，根据化学发光强度定量确定待测mirna的浓度。

9、进一步的，步骤2中，所述待测mirna包括四种，分别为mirna-21、mirna-16、mirna-221和mirna-155；与其对应的四种发夹探针h1分别为h1-21、h1-16、h1-221和h1-155，序列分别如seq id no.1～seq id no.4所示。

10、进一步的，步骤2中，所述发夹探针h2包括h2-21、h2-16、h2-155和h2-221，序列分别如seq id no.5～seq id no.8所示。

11、进一步的，步骤3中，所述发夹探针h3的序列如seq id no.9所示。

12、进一步的，步骤3中，所述发夹探针h4的序列如seq id no.10所示。

13、进一步的，步骤1中，将发夹探针h1固定在石英阵列检测孔底部的具体方法为：

14、首先，用piranha洗液清洗检测孔，然后用乙醇和超纯水清洗、吹干，加入aptes、室温反应，使检测孔表面氨基硅烷化；而后，洗涤去除未反应的aptes，高温固化后，加入戊二醛反应以实现检测孔的醛基化修饰，然后冲洗去除多余的戊二醛；最后，将不同的发夹探针h1分别加热后水浴孵育，随后将处理后的发夹探针h1加入相应的检测孔内、反应过夜，从而通过戊二醛连接实现不同mirna的捕获发夹探针h1在微孔阵列中的修饰。

15、进一步的，步骤2和3中，所述发夹探针h2、发夹探针h3和发夹探针h4在加入检测单元之前，均经加热后水浴孵育处理，再加入各检测单元内。

16、本发明的第二方面提供了一种多种mirna同时检测试剂盒，所述试剂盒包括发夹探针h1、发夹探针h2、发夹探针h3和发夹探针h4，其中所述发夹探针h1、发夹探针h2与对应mirna可发生催化发夹自组装反应；所述发夹探针h3末端标有3/4的g-四链体序列，发夹探针h4末端标有1/4的g-四链体序列，发生杂交链式反应并形成完整的g-四链体脱氧核酶。

17、进一步的，所述发夹探针h1分别为h1-21、h1-16、h1-221和h1-155，序列分别如seqid no.1～seq id no.4所示。

18、进一步的，所述发夹探针h2包括h2-21、h2-16、h2-155和h2-221，序列分别如seqid no.5～seq id no.8所示；所述发夹探针h3的序列如seq id no.9所示；所述发夹探针h4的序列如seq id no.10所示。

19、本发明相比现有技术的优点和有益效果是：

20、1、催化发夹自组装反应和杂交链式反应作为典型的无酶等温扩增方法，具有特异性强、条件温和、成本低、操作简便等突出优点，本发明所述基于催化发夹自组装和杂交链式反应的多种mirna同时检测方法，将催化发夹自组装反应和杂交链式反应两种恒温放大手段相结合，既具有催化发夹自组装反应和杂交链式反应的级联放大作用，又融合了g-四链体脱氧核酶优良的催化性能，借助g-四链体脱氧核酶的类辣根过氧化物酶催化活性，实现对多种mirna的同时可视化化学发光成像检测；

21、2、本发明所述基于催化发夹自组装反应和杂交链式反应的多种mirna同时检测方法，具有很强的通用性，可适用于疾病相关的更多种类mirna的同时筛查；同时该方法借助手机或其它成像拍照系统即可可视化读出信号，符合即时诊断的要求，在临床样本检测中有很大的应用潜力。