抗猪胆囊收缩素与生长抑素二联卵黄抗体及其制备方法

本发明属于生物，具体涉及抗猪胆囊收缩素与生长抑素二联卵黄抗体及其制备方法。

背景技术：

1、动物的生长速度与肉产品的质量对于畜牧与饲养业一直是十分关键的问题，也一直是生物学家们一直研究的热点问题。一般来说，每个动物体内的组织器官都会产生抑制因子，可以对动物的生长进行特异性抑制从而防止其自身的过度生长，这个过程一般通过组织器官在生长发育的过程中产生的抑制性物质来实现，组织器官的正常生长也得益于积累到一定程度的抑制性物质。

2、胆囊收缩素（cholecystokinin，cck）是一种既可以由中枢神经细胞，又可以由小肠近端i细胞分泌的脑肠肽，广泛存在于生物的消化系统、神经中枢及外周神经系统，能够促进胰酶分泌和收缩胆囊的作用，还可以刺激胰腺分泌从而增进胃肠道运动。在生物学功能方面，cck可引起饱腹感，具有很强的抑食作用，通常的作用机理是通过对胃分泌系统的调节，直接抑制胃酸分泌，减慢进食之后胃内食物的消化与排空，作为一种内源性饱感信号，在食欲调控中发挥着相当关键的作用。也有研究表明胆囊收缩素对生物的心理情绪也同样起着一定的作用，作为一种主要的致焦虑介质，其对动物的神经焦虑方面起着调控作用。目前对于胆囊收缩素的研究主要集中在动物生产方面，利用猪的免疫系统，达到一定含量与浓度的cck能显著提高猪的日增重和全期采食量。依据cck的免疫中和技术，cck起到的饱感作用可以得到显著降低，由于动物无法知晓自己是否吃饱，进而能够增加动物的进食量，促进动物长大，含有cck抗体的蛋黄能有效改善断奶仔猪的生长性能，并降低血清中的cck含量。目前用cck-8作为抗原是大多数研究者所青睐的，通常这种cck-8是通过化学合成的方式获得的，包括硫酸化cck（s cck）与未硫酸化cck（ns cck），缺点就在于上述两种合成的cck-8都很昂贵，并且硫酸化cck结合cck-ar的亲和力比非硫酸化cck要高500-1000倍，且制作复杂，所以s cck更昂贵。从cck制备的单体经济效益比来看，化工合成的方式并不能应用于大规模的生产中去。

3、生长抑制素（somatostatin，ss）能抑制生长激素分泌的调节型神经多肽，ss集神经激素、神经递质以及激素三者于一身的特性，使得其生物学作用较胆囊收缩素更为广泛，在神经系统调节方面，生长抑素对下丘脑、大脑皮层和脊髓神经元有明显的抑制作用，使动物的运动、睡眠、记忆、能量消耗等基础生物功能过程发生改变；在内分泌系统方面，其能抑制由垂体释放的多种激素的分泌，如降钙素、甲状旁腺素、促甲状腺激素释放激素的释放；生长抑制素对神经递质也有影响，据研究表明，若给药于动物的生长抑制素分泌中枢会显著的影响ne能、nmda能、da能和ach能等神经递质。ss作为抑制因子，调节着动物的消化功能，对胃的运动以及胰、肠胃的分泌功能同样起着显著的抑制作用。目前已经有一些研究用ss或人工合成 ss类似物进行主动免疫，使动物自身产生抗ss抗体，并对体内的ss进行中和，从而消除对生长激素的抑制，促进动物的生长。由于ss肽链很短并且免疫原性很弱，需要同其他载体蛋白连接以增强免疫原性。huang等研究用木聚糖酶与ss基因进行融合表达，制备了具有良好免疫原性与抗原性的木聚糖酶-ss融合蛋白，可作为双功能疫苗喂养酶蛋白；han等研究以减毒沙门氏菌霍乱塞氏菌c500介导，构建了ss基因的dna疫苗，且免疫结果显示该疫苗能有效的诱导小鼠产生ss特异性抗体；周子超的前期研究表明，基因免疫生长抑素可以促使动物产生抗生长抑素抗体并中和内源性的生长抑素，阻断生长抑素与其受体作用，促进生长激素、胰岛素样因子-1等多种激素的分泌释放，从而促进动物的生长，改善动物的生产性能。目前，利用基因免疫技术来提高家畜的生长速度是比较理想的方式，用生长抑素基因构建dna疫苗能有效促进动物生长，这种效果已经在多项研究中被报道，其通过诱导机体产生生长抑素抗体来中和内源性生长抑素而解除生长抑素的生长抑制作用，但这种方法成本较高，且不易保存。

4、cck受体的制备较为昂贵，不适合大量生产，并且ss肽链较短并且免疫原性弱，需要同其他载体蛋白连接以增强免疫原性，所以在畜牧养殖业中要广泛实施并不太现实。通过分子克隆和原核表达技术制备抗原蛋白，相比其他生产方式而言，第一，其具有经济实惠且发展前景较好的技术实践特点，第二，抗体蛋白蛋白在进入动物体内后，容易被动物肠道消化分解，不会出现在生物体内残留的问题，第三，生长激素等激素由于半存活期比较短，存在使用持续时间较短的问题，而抗体则不存在这种问题。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中cck的成本高昂以及ss半存活期短、免疫原性弱的问题，本发明将cck和ss进行基因串联表达，以获得重组猪胆囊收缩素和生长抑制素融合蛋白，其可以用于对动物进行主动免疫或被动免疫，也能用于特异性卵黄抗体和为研制猪的促生长制剂提供一项基础原料。

2、本发明采用如下具体方案：

3、一种重组猪胆囊收缩素和生长抑制素融合蛋白，其特征在于，所述重组猪胆囊收缩素和生长抑制素融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、制备所述重组猪胆囊收缩素和生长抑制素融合蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）构建pcold-pcck-ss重组载体；（2）转化到感受态的大肠杆菌transetta(de3)，制备得到重组菌株transetta(de3)-pcold-pcck-ss；（3）对重组菌株transetta(de3)-pcold-pcck-ss进行诱导表达，从而制备得到所述重组猪胆囊收缩素和生长抑制素融合蛋白。

5、优选地，所述构建pcold-pcck-ss重组载体是将seq id no.2所示的核苷酸序列经酶切后与经酶切的pcold质粒连接得到。

6、所述诱导表达的具体方法是将活化好的transetta(de3)-pcold-pcck-ss菌液置于冰水混合物中，静置30 min，使菌液温度降温至15 ℃，加入300 µl iptg使得iptg的终浓度为1 mmol/l，15 ℃，220 r/min诱导16～18 h。

7、本发明还请求保护一种抗猪胆囊收缩素与生长抑素二联卵黄抗体，其特征在于，其是以权利要求2-4任一项制备得到的重组猪胆囊收缩素和生长抑制素融合蛋白为免疫原，对蛋鸡进行免疫制备得到。

8、优选地，所述卵黄抗体的制备方法包括如下步骤：

9、（1）疫苗制备：以权利要求2-4任一项制备得到的重组猪胆囊收缩素和生长抑制素融合蛋白为免疫原，疫苗佐剂为montanidetm isa 71avg，将质量比30％的比例将抗原加入到佐剂montanidetmisa 71vg中乳化，剪切参数：7000r/min，15℃以下，乳化30min；

10、（2）动物免疫：将产蛋高峰期的蛋鸡按照1 ml/羽免疫剂量，鸡胸部两侧肌肉注射，每侧0.5 ml，每只鸡免疫三次，首次免疫和二次免疫隔三周，第二次和第三次免疫间隔隔一个月；

11、（3）卵黄抗体（igy）的提取。

12、本发明还请求保护一种抗猪胆囊收缩素与生长抑素二联卵黄抗体制剂，其特征在于，所述卵黄抗体制剂是选取抗体效价≥1:12800的免疫鸡蛋，分离卵清与卵黄，收集卵黄进行均质，加入等质量的麦芽糊精，而后在45-50℃下进行低温烘干至含水量≤10%，经粉碎即制备得到卵黄粉。

13、本发明还请求保护所述抗猪胆囊收缩素与生长抑素二联卵黄抗体在制备猪饲料中的应用，其特征在于，在饲料中添加所述抗猪胆囊收缩素与生长抑素二联卵黄抗体可以有效提高猪的采食量、增重量，降低料肉比。

14、优选地，所述猪为仔猪。优选地，所述抗猪胆囊收缩素与生长抑素二联卵黄抗体在饲料中的添加量为1%（w/w）。

15、基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：

16、首先，本发明首次将cck和ss进行联合表达，分别构建了重组表达载体pet28a-pcck-ss和pcold-pcck-ss，制备得到相应的重组菌株，然而，经研究发现，其中在pet28a载体中，重组蛋白pcck-ss在包涵体中少量表达，经western blot检测为阴性，其可能是pet28a中蛋白表达效率降低或表达条件不适宜；在以上研究的基础上，本发明采用冷休克载体pcold gst dna作为与pcck-ss连接的载体。用质粒pcold gst转化大肠杆菌感受态细胞transetta(de3)，筛选单克隆菌株，经酶切鉴定为阳性，对酶切产物进行纯化获取线性化载体pcold，结果显示pcold纯化产物条带明亮且无杂带，说明该质粒的拷贝能力高，且纯化试效果较好，成功在上清与沉淀中表达了重组蛋白pcck-ss。

17、其次，本发明首次制备得到了重组蛋白pcck-ss，并将其作为免疫原对蛋鸡进行免疫制备得到了抗猪胆囊收缩素与生长抑素二联卵黄抗体，经检测，当cck-ss抗体效价达到高峰时，本发明制备得到的卵黄抗体ig y的最高效价为1：102400以上。本发明进一步将其制成制剂用于猪饲料的制备，试验表明，本发明饲喂包含抗猪胆囊收缩素与生长抑素二联卵黄抗体的饲料的试验组，其采食量相对于空白对照组提高了18.64%，相对饲喂普通卵黄粉的对照组，其采食量提高了16.75%；且仔猪的平均日增重也达到了最高，其相对空白对照组提高了38.62%，相比对照组提高了25.46%，料肉比体现为较大幅度的降低，相对空白对照组降低了14.41%，相比对照组降低了6.95%。基于以上试验结果可知，在仔猪日粮中添加本发明的抗猪胆囊收缩素与生长抑素二联卵黄抗体可以有效地提高仔猪的采食量和平均日增重，降低料肉比，极大地提高养殖的经济效益。

18、综上，本发明首次将cck和ss进行联合表达，通过选择冷休克载体pcold gst dna，构建了pcold-pcck-ss，制备得到transetta(de3)-pcold-pcck-ss重组菌，其可以高效地表达pcck-ss重组蛋白，且将该蛋白用于蛋鸡免疫，可以获得最高效价为1：102400以上的卵黄抗体，将该卵黄抗体用于猪饲料，可以有效地提高仔猪的采食量和平均日增重，降低料肉比，极大地提高养殖的经济效益。