本发明涉及细胞培养，具体为一种外周血nk细胞的体外诱导扩增培养方法。
背景技术：
1、nk细胞是血液和淋巴系统中一种重要的白细胞，具有自然免疫、抗病毒、抗肿瘤等功能，在身体免疫细胞成分中，nk细胞是第一线的免疫防线，在大多数感染和肿瘤遇到异物时，都会对其立即发起反应，因此，nk细胞在肿瘤免疫治疗和细胞免疫治疗中具有广泛的应用前景，但是，由于外周血中nk细胞数量较少，免疫功能不易激活，限制了其在临床应用中的发挥，故提高nk细胞的数量和活性具有重要的临床应用意义；
2、目前的外周血nk细胞的体外扩增培养主要采用外围血干细胞的方法，需要剥夺干细胞的成熟细胞形态，并进行适当的刺激和诱导，以诱导增殖和分化成为免疫细胞，但是，这种方法存在较高的成本、复杂的技术操作、不易控制的培养环境等问题，限制了nk细胞的体外培养及其临床应用，因此，需要提供一种更加简单、有效、稳定的方法，以提高nk细胞的数量和活力，为此，我们提出了一种外周血nk细胞的体外诱导扩增培养方法。
技术实现思路
1、鉴于现有技术中所存在的问题，本发明公开了一种外周血nk细胞的体外诱导扩增培养方法，采用的技术方案是，包括以下步骤：
2、步骤一：采集外周血中分离出含nk细胞的单个核细胞(pbmc)；
3、步骤二：将pbmc分离出nk细胞；
4、步骤三：将分离出来的nk细胞以5*105个/毫升的浓度保存在rpmi-1640培养基中，并存放在37℃、5％co2的培养箱中；
5、步骤四：将培养罐中的细胞检测划痕和细胞增殖情况，细胞密度达到1*106个/毫升时进行第一次传代；
6、步骤五：第一次传代后，将细胞培养到细胞密度到达5*105个/毫升，进行第二次传代，扩增nk细胞种类并净化；
7、步骤六：根据需要对nk细胞进行检测，如细胞活性、表面标志物；
8、步骤七：收集检测后的培养nk细胞。
9、作为本发明的一种外周血nk细胞的体外诱导扩增培养方法优选技术方案，所述nk细胞短期培养的时间为两周以内。
10、作为本发明的一种外周血nk细胞的体外诱导扩增培养方法优选技术方案，所述nk细胞所采用的分离方法为磁珠分选、细胞免疫磁珠分选、细胞分选、黏附法或单核细胞贴壁法之一。
11、作为本发明的一种外周血nk细胞的体外诱导扩增培养方法优选技术方案，所述rpmi-1640培养基中添加10％胎牛血清和1％人血浆以及1-10ng/ml il-2、1-5ng/ml il-15、0.2-1ng/ml il-21、0.05-0.5ng/ml tgf-β。
12、作为本发明的一种外周血nk细胞的体外诱导扩增培养方法优选技术方案，所述rpmi-1640培养基每3-4天半液更换一次，并向rpmi-1640培养基中添加0.1-5ng/ml il-2、0.1-2.5ng/ml il-15、0.01-0.5ng/ml、il-21和0.05ng/ml tgf-β。
13、作为本发明的一种外周血nk细胞的体外诱导扩增培养方法优选技术方案，所述胎牛血清和人血浆的浓度调整至10％以下或者1％以上，以适应不同的细胞生长状态。
14、作为本发明的一种外周血nk细胞的体外诱导扩增培养方法优选技术方案，所述的细胞密度达到1×106个/毫升时进行第一次传代，且第一次传代后通过扩增可净化nk细胞。
15、作为本发明的一种外周血nk细胞的体外诱导扩增培养方法优选技术方案，所述检测nk细胞活性和表面标志物可用于筛选最佳的nk细胞。
16、本发明的有益效果：
17、1、本发明的nk细胞培养周期短，可以快速让nk细胞增殖扩增；
18、2、培养方法简单，无需复杂设备和技术，成本较低；
19、3、通过本发明方法，可快速、高效、稳定的将nk细胞扩增到足够种类，稳定的维持在培养基中，确保细胞活力和数量的同时并筛选培养出最佳的nk细胞。
1.一种外周血nk细胞的体外诱导扩增培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种外周血nk细胞的体外诱导扩增培养方法，其特征在于：所述nk细胞短期培养的时间为两周以内。
3.根据权利要求1所述的一种外周血nk细胞的体外诱导扩增培养方法，其特征在于：所述nk细胞所采用的分离方法为磁珠分选、细胞免疫磁珠分选、细胞分选、黏附法或单核细胞贴壁法之一。
4.根据权利要求1所述的一种外周血nk细胞的体外诱导扩增培养方法，其特征在于：所述rpmi-1640培养基中添加10％胎牛血清和1％人血浆以及1-10ng/ml il-2、1-5ng/ml il-15、0.2-1ng/ml il-21、0.05-0.5ng/ml tgf-β。
5.根据权利要求4所述的一种外周血nk细胞的体外诱导扩增培养方法，其特征在于：所述rpmi-1640培养基每3-4天半液更换一次，并向rpmi-1640培养基中添加0.1-5ng/ml il-2、0.1-2.5ng/ml il-15、0.01-0.5ng/ml、il-21和0.05ng/ml tgf-β。
6.根据权利要求4所述的一种外周血nk细胞的体外诱导扩增培养方法，其特征在于：所述胎牛血清和人血浆的浓度调整至10％以下或者1％以上，以适应不同的细胞生长状态。
7.根据权利要求1所述的一种外周血nk细胞的体外诱导扩增培养方法，其特征在于：所述的细胞密度达到1×106个/毫升时进行第一次传代，且第一次传代后通过扩增可净化nk细胞。
8.根据权利要求1所述的一种外周血nk细胞的体外诱导扩增培养方法，其特征在于：所述检测nk细胞活性和表面标志物可用于筛选最佳的nk细胞。