一种柑橘木虱中DNA病毒和RNA病毒及HLB病菌的检测方法

本发明涉及病原检测，具体涉及一种柑橘木虱中dna病毒和rna病毒及hlb病菌的检测方法。

背景技术：

1、柑橘木虱(asian citrus psyllid,acp)是同翅目(homoptera)木虱科(psyllidae)昆虫，主要危害芸香科植物，携带病原的柑桔木虱会严重影响柑橘果实的产量。柑橘木虱的口器为刺吸式口器，成虫具有趋黄性，但不具有趋光性。柑橘木虱可以分为亚洲柑橘木虱(diaphorina citri)和非洲柑橘木虱(trioza erytreae)，我国的柑橘木虱主要为亚洲种。

2、柑橘黄龙病(huang long bing,hlb)是一类由韧皮部寄生的革兰氏阴性菌韧皮部杆菌引起的柑橘类植物病害。柑桔黄龙病是柑桔产业中的一种毁灭性病害，被称为柑桔的癌症，又称青果病、枯黄病、黄梢病。柑橘木虱(asiancitruspsyllid,acp)是传播黄龙病病原菌(candidatus liberibacter asiaticus,clas)的媒介昆虫，也是导致hlb盛行的重要因素。目前，有效防控hlb的方法尚未发现，而防控其传播媒介柑橘木虱是预防hlb流行的重要措施之一。通常利用化学方法防控柑橘木虱，但化学防治易引起媒介昆虫的抗药性，污染环境，并且可能对有益生物产生负面影响。一些昆虫病毒可能影响媒介的生物学特性及传播病原的能力，了解中国不同地区单头柑橘木虱中病毒的携带情况，分析这些病毒与hlb病菌的复合感染情况，为寻找可能用于柑橘木虱的生物防治材料奠定基础。探究木虱中的病毒是否介导了hlb病菌的媒介传播具有重要意义。

3、病毒作为地球上最丰富的微生物，存在于所有生物群体中。随着宏基因组学的发展，越来越多的病毒被发现，包括杆状病毒科(baculoviridae)，细小病毒科(parvoviridae)，黄病毒科(flaviviridae)和布尼亚病毒科(bunyaviridae)等。病毒一般可分为dna病毒和rna病毒，rna病毒的核酸是rna，并且通常在细胞质中用rna复制酶进行复制；dna病毒的核酸是dna，通常在细胞核内进行复制。

4、一些病毒与它们的昆虫宿主有着复杂的作用关系，影响昆虫的生长发育或帮助传播病原体。mizuri等通过高通量测序在柑橘木虱中发现了两条呼肠孤病毒(diaphorinacitri reovirus,dcrv)序列。nouri(nouri,s.,et al.,diverse array of new viralsequences identified in worldwide populations of the asian citrus psyllid(diaphorina citri)using viral metagenomics.journal of virology,2016.90(5):p.2434-2445)等发现了类小核糖核酸病毒(diaphorina citri picorna-like virus,dcplv)、类布尼亚病毒(diaphorina citri bunyavirus,dcbv)、柑橘木虱相关c病毒(diaphorina citri-associated c virus,dcacv)以及一种dna病毒，类浓核病毒(diaphorina citri densovirus-like virus,dcdv)。britt(britt,k.,et al.,thedetection and surveillance of asian citrus psyllid(diaphorina citri)—associated viruses in florida citrus groves.frontiers in plant science,2020.10)等发现了柑橘木虱类黄病毒(diaphoerina citri flavi like virus,dcflv)和又一种类呼肠孤病毒(diaphorina citri cimodo-like virus,dcclv)，并以5头柑橘木虱为1个样本，检测了美国佛罗里达州木虱中这些病毒的携带情况，发现dcacv在佛罗里达柑橘木虱中检出率最高。

5、然而，目前，中国柑橘木虱中昆虫病毒的携带情况尚不清楚，并且木虱中昆虫病毒是否与hlb感染有关也未可知，缺少一种能方便快捷地检测柑橘木虱中病毒和hlb病菌的检测方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对上述问题，提供一种柑橘木虱中dna病毒和rna病毒及hlb病菌的检测方法。

2、本发明为了实现其目的，采用的技术方案是：

3、本发明第一方面提供了一种分离的生物体，其包含seq id no.45、seq id no.46、seq id no.47所示的crna序列。

4、上述的分离的生物体，其是rna病毒，其l基因、m基因、s基因的核苷酸序列依次如seq id no.45、seq id no.46、seq id no.47所示。

5、上述生物体是类布尼亚病毒diaphorina citri bunyavirus2,dcbv2。

6、本发明的第二方面提供一种用于扩增dcbv2的引物对，所述引物对的上下游引物的序列如下：

7、f:5'gttagccaagccatacaatc3'，

8、r:5'tgaagtcaccaacccatcta3'。

9、本发明的第三方面提供上述的用于扩增dcbv2的引物对在鉴定病原体中的应用，其中所述鉴定是指：

10、确定待测病原体是否是前述任一项所述的分离的生物体；或者

11、确定样本中是否存在前述任一项所述的分离的生物体。

12、优选所述应用为上述的扩增dcbv2的引物对在鉴定动物中病原体感染中的应用，优选所述动物为柑橘木虱。

13、本发明的第四方面提供一种检测病原体的方法，包括如下步骤：

14、1)提供待测样本；

15、2)获得所述待测样本的rna；

16、3)用上述的扩增dcbv2的引物对对步骤2)获得的rna进行rt-pcr扩增；

17、4)确定是否存在目标产物。

18、在上述的方法的技术方案中，

19、所述rt-pcr扩增程序为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s和72℃延伸1min，共35个循环；72℃终延伸10min；

20、所述目标产物的大小为904bp。

21、本发明的第五方面提供一种检测柑橘木虱中病原病毒及hlb病菌的检测方法，包括如下步骤：

22、1)提取柑橘木虱的总rna；

23、2)以提取到的总rna为模板，进行rt-pcr检测，判断是否扩增到目标条带；所述病原病毒包括dcrv、dcplv、dcbv、dcdv和dcbv2中的一种或多种，不同的检测对象分别进行rt-pcr检测。

24、在上述的检测方法的技术方案中，所述rt-pcr时，不同检测对象对应的扩增引物序列和扩增片段大小以及tm如下：

25、

26、

27、在上述的检测方法的技术方案中，rt-pcr扩增程序为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃变性30s，tm℃退火30s和72℃延伸1min，共35个循环；72℃终延伸10min。

28、本发明的有益效果是：首次鉴定确认了一种类布尼亚病毒diaphorina citribunyavirus2(dcbv2)，在此基础上，建立了柑桔木虱中dcbv2的检测引物对和检测方法。通过研究，发现对于柑桔木虱中的多种病原病毒和hlb病菌，采用dna作为检测对象不能同时检测出dna病毒、rna病毒和hlb病菌，而采用rna则能同时检测出，一次提取即可检测多种病原病毒和hlb病菌，操作简单，简化了检测操作流程，节省检测时间和检测成本。