一种来源于嗜热链球菌的氨肽酶S及其制备方法与应用

本发明涉及基因工程重组蛋白酶，具体涉及一种来源于嗜热链球菌的氨肽酶s及其制备方法与应用。

背景技术：

1、氨肽酶是一类外肽酶，从蛋白质或肽链的n末端选择性切割氨基酸残基，一般作用范围较广，是人们较早发现的一类酶。根据水解n端氨基酸残基专一性程度的不一样，将氨肽酶分为两大类：一类对n端氨基酸残基具有严格的专一性，只能将某一种或几种氨基酸残基特异地水解，如天冬氨酸和谷氨酸残基只能用pepa水解；这类氨肽酶包括：pepp(水解末端脯氨酸残基)、pepx(水解末端第二位为脯氨酸残基的肽)、pepi(水解末端脯氨酸亚氨基)。另一类对n端氨基酸残基专一性弱，几乎所有的氨基酸残基都能够水解，如赖氨酸氨肽酶(pepn)、亮氨酸氨肽酶(lap)、苯丙氨酸氨肽酶(pepm)。氨肽酶的酶解产物为小肽和游离氨基酸，由于小肽和游离氨基酸是食品中重要的营养物质和风味，因此氨肽酶在食品调味品工业中受到广泛的关注。

2、乳酸菌(lacticacidbacteria,lab)是一类异源性革兰氏阳性细菌的总称，其共同的特征是发酵碳水化合物形成终产物乳酸。大多数的lab都是氨基酸的营养缺陷型，但能在复合蛋白质的培养基上生长良好，说明其具有强大的蛋白水解系统，因而lab是蛋白水解酶类的丰富资源。嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)是lab中的一个重要成员，广泛用于乳制品工业，如酸奶及硬质干酪的制备。相比lab其他成员，嗜热链球菌蛋白水解系统更为丰富，而氨肽酶s(pep s)为嗜热链球菌所特有，预示其有独特的蛋白水解特性和应用价值。目前，还没有通过重组dna技术制备该酶及对重组酶生物学特性进行研究，并指导该酶应用的报道。

3、为此，本发明旨在提供一种来源于嗜热链球菌的peps及其制备方法、生物学特性和潜在应用，以解决上述问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种来源于嗜热链球菌的氨肽酶s及其制备方法与应用。

2、为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：本发明提供一种peps，所述peps为蛋白酶，所述peps的氨基酸序列如seq id no：1所示。

3、本发明还提供一种核苷酸片段，所述核苷酸片段用于编码所述的peps。

4、进一步地，所述核苷酸片段的序列如seq id no：2所示。

5、本发明还提供一种重组表达载体，所述表达载体为携带如上所述的核苷酸片段的表达载体。是将编码上述peps核苷酸片段插入到载体中构建而成。

6、进一步地，所述重组表达载体为毕赤酵母表达载体phb905m-peps。

7、本发明还提供一种peps的表达方法，所述表达方法是通过在宿主细胞中转入上述的重组表达载体，进行高密度发酵并配合诱导剂诱导peps的表达。进一步地，所述宿主细胞为毕赤酵母gs115。

8、本发明还提供了一种一步分离纯化peps的方法，即经固定化的ni2+亲和层析，peps纯度达到95％以上。

9、本发明还提供了上述peps生物学特性。即该酶是一个专一性较弱的氨肽酶，对碱性氨基酸(arg)、芳香族氨基酸(trp、tyr、phe)和疏水氨基酸(leu)为n端的肽链都具有水解作用，但对酸性氨基酸(asp、glu)为n端的肽链不起作用。该酶可被多数二价阳离子和金属蛋白酶抑制剂抑制，二硫键的还原剂和金属离子螯合剂edta对该酶也有很强的抑制作用，但丝氨酸蛋白酶抑制剂及羧肽酶抑制剂对该酶都没有抑制作用。这些特性的发现对指导该酶的应用具有重要的意义。

10、本发明还提供上述peps在食品调味品工业中的潜在应用。即该酶可与其他内肽酶和外肽酶如谷氨酸氨肽酶pepa(水解酸性氨基酸asp或glu为氨基端的肽链)联合使用，可以有效降解食物中的苦味肽，同时增加食物中芳香族氨基酸(trp、tyr、phe)及酸性氨基酸(glu、asp)的含量，使食物更具芳香和风味。

11、以下为本发明方案涉及的序列：

12、seq id no：1(peps氨基酸序列)：

13、mvlpnfkenlekyakllvtnginvqpghtvalsidveqaelahllvkeayalgaaevivq

14、wsddtinrerflhaemnrieevpaykkaemeyllekkasrlgvrssdpdafngvaperls

15、ahakaigaafkpmqvatqsnkvswtvaaaagkewakkvfpnassdeeavdllwnqifktc

16、rvyekdpvrawkehadrldakarilneaqfsalhytapgtdltlglpknhvwesagaina

17、qgesflpnmpteevftapdfrraygyvrstkplsyggniiegikvtfkdgeavditadqg

18、ekvlknlvfnnngaralgecalvpdsspisqsnitffntlfdenasnhlaigaayafsve

19、ggadmteeelkaaglnrsdvhvdfiigsnqmnidgihhdgsrvpifrngdwvi

20、seq id no：2(peps编码基因的核苷酸序列)：atggttttaccaaattttaaagaaaatcttgagaaatatgctaaattattggttactaatgggattaatgtgcagcctggtcacacagtggccttgagcattgatgtagaacaagcagagctggctcacctcttagtaaaagaagcttatgctttaggagcagctgaggtaattgttcaatggtcggatgatactattaatcgcgagcgtttcttgcatgcagagatgaatcgaatcgaagaggttccagcttataaaaaagcggagatggaatatttgttagaaaagaaagcaagtcgtttaggagtccgttcttctgatccagatgcctttaatggtgtagctcctgaacgtctatctgctcatgctaaggctattggagcggcctttaaacctatgcaggtagcaactcagtctaataaggttagttggacagtagctgcagcagcaggtaaagaatgggctaagaaggtctttcctaatgcttcgagtgatgaggaagccgtagatttactttggaaccaaattttcaagacctgtcgtgtttacgaaaaggatcctgtacgtgcctggaaggaacatgctgatcgtttagatgctaaagcacgtatactcaatgaagcacaattctcagcccttcattacacagcaccaggaacagatttgacccttggtttgccgaaaaaccacgtttgggagtctgcaggtgcaatcaatgcccagggggagagcttccttcctaatatgccaacagaagaggtctttacggcaccagatttccgtcgtgcatatggttatgtccgtagtacaaaaccactaagctatggtggtaatattattgagggaatcaaagtaacattcaaagatggtgaagctgtagatattacagcagaccaaggtgagaaagtgctgaagaatctcgtcttcaacaataatggggcgcgtgctctaggtgaatgtgccttggtaccagattcaagccctatttcacaatctaacattaccttcttcaataccctctttgatgagaatgcatccaaccacctagctattggagcagcctatgcgttcagtgttgagggaggagcagatatgacagaagaggaacttaaagcagctggtcttaaccgttctgatgtacatgtagattttataattggctcaaatcaaatgaatattgatggcatccaccatgatggtagccgtgtaccaatcttccgaaatggtgattgggtgatt

21、与现有技术相比，本方案的有益效果：本发明提供了一个新的peps编码基因并首次实现了peps在毕赤酵母中的分泌表达，提供了其分离制备方法。本发明还提供了peps生物学特性及其潜在应用价值。