OsCOL5基因在调控水稻抽穗期中的应用的制作方法

本发明属于植物基因工程领域，具体地说，涉及oscol5基因在调控水稻抽穗期中的应用。

背景技术：

1、植物通过感知周围环境，例如日照长度(光周期)、温度等，调节植物生长发育，主要包括营养生长和生殖生长两个时期(雍伟东等，2000)。其中，开花是两个生长阶段过渡的重要标志，这是一个十分复杂和精细的过程，其受遗传和环境因素共同调控(simpson etal.，2002)。在拟南芥和水稻中，开花的调控可归纳为五条途径：光周期途径、春化途径、自主途径、赤霉素途径和年龄途径(carré et al.，2018；wei et al.，2020)。其中，经典的光周期调控途径研究得最为广泛和深入。

2、garner和allard于1920年提出了光周期的概念，是指昼夜周期中光期和暗期长短的交替变化。光周期在相同地区是一个相对稳定的环境影响因子，大多数一年生植物的开花决定于每天日照时间的长短。根据光周期的类型分类，拟南芥和水稻分别是典型的长日(长日照下促进开花)和短日(短日照下促进开花)植物，也是双子叶和单子叶植物研究的模式植物。constans(co)和hd1是重要的开花整合因子，拟南芥co仅在长日照下促进开花。在水稻中，hd1进化出双重功能，在短日照下促进抽穗，而在长日照下抑制抽穗(yano etal.2000)。拟南芥和水稻中都有一条在进化上保守的核心光周期开花途径，gi-co-ft和osgi-hd1-hd3a/rft1，co/hd1可以直接作用于ft/hd3a的启动子上(carré et al.，2018)。最近，hd1转换活性调控光周期的分子机制被部分解释(zong et al.，2021)。hd3a和rft1都是ft的同源基因，位于同一染色体上，相隔距离较近，分别在短日照和长日照下促进抽穗，并存在功能冗余现象(komiya et al.，2008&2009)。此外，水稻还有一个进化独特的ghd7-ehd1-hd3a/rft1调控途径，ghd7和ehd1是水稻特有的基因，在拟南芥中并没有发现它们的同源基因(doi et al.，2004；xue et al.，2008)。在以前的报道中发现了多个位于ehd1上游并进行抽穗期调控的基因，例如osrr1、ghd7、hd1和osre1等(cho et al.2016；nemoto etal.2016；chai et al.，2021)。ghd7属于cct蛋白，主要在长日照下抑制ehd1的表达来抑制抽穗。hd1和ghd7形成复合体，作用于ehd1的启动子上(nemoto et al.，2016)。最近的研究表明，这两个途径并不是完全独立的，ghd7、hd1和dth8三个蛋白可以形成不同的蛋白复合体(二聚体或三聚体)来调控ehd1表达，表现出不同的光周期敏感性差异(zong et al.，2021)。hd1、dth8和osnf-yc2/osnf-yc7复合体能结合到hd3a的启动子上抑制水稻抽穗(shen et al.，2020)。

3、co-like属于b-box转录因子家族，其编码的蛋白一般包含两个保守的结构域：b-box(bbx)和cct结构域。目前，研究人员已经从30余个物种中都克隆到co同源基因，在拟南芥中发现17个co-like基因。水稻中至少存在16个co-like基因(griffith et al.，2003)，目前有9个基因已经被成功克隆。根据b-box的类型，可以将其分为三类。第一类含两个连续的b-box结构域，包括hd1、osc03和oscol4(yano et al.，2000；kim et al.，2008；lee etal.，2010)；第二类含一个b-box结构域，包括ghd2、oscol10和oscol16(liu et al.，2016；tan et al.，2016；wu et al.，2017)；第三类含两个不同的b-box，包括dth2、oscol13和oscol15(wu et al.，2013；sheng et al.，2016；wu et al.，2018)。在水稻育种中，通过基因工程技术创制抽穗期差异的水稻种质是目前水稻不同品种广泛种植于不同地区的最佳策略。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供oscol5基因在调控水稻抽穗期中的应用。

2、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供oscol5基因在调控水稻抽穗期中的应用，其中，oscol5基因为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

3、(a)由seq id no：3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

4、(b)seq id no：3所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

5、oscol5基因序列为：

6、i)seq id no：1所示的dna核苷酸序列；

7、ii)seq id no：2所示的cdna核苷酸序列。

8、进一步地，在水稻中过表达oscol5基因延迟水稻抽穗期，抑制开花。

9、所述过表达的方式可选自以下1)～5)，或任选的组合：

10、1)通过导入具有所述基因的质粒；

11、2)通过增加植物染色体上所述基因的拷贝数；

12、3)通过改变植物染色体上所述基因的启动子序列；

13、4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接；

14、5)通过导入增强子。

15、第二方面，本发明提供一种延迟水稻抽穗、抑制开花的方法，采用农杆菌介导的方法，将携带有oscol5基因cdna序列的重组表达载体转入水稻愈伤组织中，转化后的材料经过共培养筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因水稻植株。

16、进一步地，所述方法包括：利用引物oscol5-ox-f和oscol5-ox-r，以水稻品种日本晴cdna为模板进行pcr扩增，将扩增片段构建到植物表达载体上，采用农杆菌介导的方法转化水稻，筛选转基因水稻植株；

17、其中，所述引物oscol5-ox-f和oscol5-ox-r的核苷酸序列如seq d no：5和6所示。

18、进一步地，所述重组表达载体的出发载体可以是pcambia2300。

19、进一步地，所用农杆菌可以是eha105。

20、本发明的转基因水稻植株在长日照和短日照条件下均延迟水稻抽穗、抑制开花。

21、第三方面，本发明提供按照所述方法获得的转基因水稻在植物育种或水稻品种改良中的应用。

22、进一步地，育种或改良目的为延迟水稻抽穗期、抑制开花。

23、育种方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

24、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

25、本发明首次揭示了oscol5基因的生物学功能，通过亚细胞定位实验发现oscol5-gfp融合蛋白定位在水稻原生质体和烟草叶片细胞的细胞核中。转录自激活实验显示oscol5基因具有很强的转录自激活活性，而结构域分析显示缺失中间结构域(δmr)或仅有cct结构域时不具自激活活性(结构域分为bbx，mr，cct)。通过组织表达研究发现，oscol5基因在幼嫩的叶片和幼穗中表达量较高。节律表达模式分析发现oscol5基因呈现明显的昼夜节律表达模式。通过在水稻品种日本晴中过表达oscol5基因发现，转基因植株表现出明显的晚抽穗表型，该基因在海南短日照和杭州长日照条件下均抑制开花。实时荧光定量pcr实验发现oscol5基因位于ghd7(os07g0261200)和ehd2(os10g0419200)的上游，且与oself3-1(os06g0142600)和oself3-2(os01g0566050)发生互作，通过促进ghd7和抑制ehd2的表达最终抑制抽穗。

26、本发明提供的水稻抽穗期调控基因为不同地区对开花相关基因进行定向优化和组合以期充分适应或扩大种植区域来提高水稻的产量提供有力工具。