过表达山羊Nramp1细胞株及在抗菌研究中的应用

本发明公开了一种获得过表达山羊nramp1基因细胞株的方法及该种细胞株在抗菌研究中的应用，属于生物。

背景技术：

1、近年来，研究宿主和病原体之间的动态相互作用对于我们理解疾病过程至关重要。天然抗性相关巨噬细胞蛋白1基因(nature resistance associated macrophageprotein 1 gene, nramp1)，是溶质转运家族成员，也被称作溶质转运载体(solutecarrier 11a1, slc11a1)，在小鼠巨噬细胞中对抵抗病原体起着关键性作用。例如：各种分枝杆菌（mycobacterium lepraemurium)、沙门氏菌(salmonella)血清型、牛分枝杆菌(m.bovis)、胞内分枝杆菌(m. intracellulare)和杜氏利什曼原虫(leishmaniadonovani）等。在巨噬细胞中，nramp1主要表达于吞噬溶酶体的细胞器膜上，并在感染的早期阶段通过运输fe2+使吞噬体内的铁含量减少，来限制胞内菌对铁的利用从而增强巨噬细胞抵抗病原体的能力。nramp1参与了宿主应对病原体的先天免疫反应，过去30年的研究已确定nramp1是宿主对抗细胞内病原体(牛分枝杆菌和鼠伤寒沙门氏菌)敏感性的主要调节因子。在小鼠中，功能性nramp1的缺失导致细菌在肝脏和脾脏中的复制不受限制，最终导致致命感染。在人类中，nramp1的遗传多态性与多种细菌性疾病相关，包括结核病和麻风病，以及炎症性肠病和类风湿性关节炎。山羊nramp1基因全长1647 bp，定位于山羊2号常染色体长臂q12.2。在山羊各个组织中，nramp1主要分布于肝脏和脾脏，在其他组织中表达量很少或基本没有表达，其中，脾脏中的表达量最高。本发明在已有基础上，建立了一种获得过表达山羊nramp1基因细胞株的方法并探究了过表达nramp1在细胞增殖以及挽救lps引起细胞凋亡的功能。本发明具有创新性强、新颖性高、安全性好等特点，为后续抗菌研究提供了可靠的技术平台。

技术实现思路

1、一、名词定义。

2、本专利所指nramp1(nature resistance associated macrophage protein 1gene)，亦称为slc11a1。山羊nramp1基因全长1647 bp，定位于山羊2号常染色体长臂q12.2。在山羊各个组织中，nramp1主要分布于肝脏和脾脏，在其他组织中表达量很少或基本没有表达，其中，脾脏中的表达量最高。nramp1是一种定位于巨噬细胞和中性粒细胞溶酶体和内吞体膜上，将二价金属阳离子(铁、锌和锰)从内吞体或溶酶体内部转运到细胞质，以交换h+。这种转运形式可以使吞噬体内细菌缺乏这些二价金属离子，并通过输入h+使溶酶体酸化向吞噬溶酶体演变，完成对细菌的裂解。

3、本专利所使用的山羊精原干细胞株(mgscs)和小鼠巨噬细胞株(raw264.7)由陕西省干细胞工程技术研究中心所保存使用。

4、本专利所使用的慢病毒表达系统由：pcdh-copgfp-t2a-puro、pax2、plp/vsvg所组成，由陕西省干细胞工程技术研究中心所保存使用。

5、二、获得过表达山羊nramp1基因细胞株

6、在ncbi中获取山羊nramp1基因cds序列(nm_001285694.1:55-1701),在5’端加上ecori(gaattc)位点，在3’端加上bamhi(ggattc)位点。共计1659 bp，将改造后的序列交于擎科生物科技公司进行基因合成，最终获得pcdh-nramp1-copgfp-t2a-puro载体，与pax2、plp/vsvg同时转染293t细胞制备带有nramp1的慢病毒颗粒。随后感染mgscs和raw264.7细胞株，经过puro(嘌呤霉素)筛选，获得oenramp1-mgscs、oenramp1-raw264.7细胞株。

7、三、鉴定过表达细胞株

8、采用rt-pcr技术在mrna水平对过表达细胞株进行鉴定，设计两对q-nramp1引物如下：

9、q-nramp1-rt1：

10、f：5’-caggctgcgttcaacatctg-3’

11、r：5’-tgggaaagatcgtcgcgtag-3’

12、q-nramp1-rt2:

13、f：5’-cgataactacgggttgcgga-3’

14、r：5’-tcatagccgaaggtcaaggc-3’

15、经rt-pcr验证，mgsc-oenramp1 细胞系其nramp1 mrna水平较对照组mgsc-pcdh上调了120倍(图1a)。在蛋白水平对过表达细胞系进行检测，结果表明在oenramp1细胞株中，其nramp1表达水平较对照组均显著上调，且mgsc-oenramp1表达水平较高，大约有1.5倍(图1b)。经rt-pcr和western blot 实验验证，表明我们成功获得了oenramp1细胞株(图1 c)。

16、四、过表达细胞株性能检测

17、分别对不同的oenramp1细胞株绘制了细胞生长曲线(图1 d)，从图中可以看出mgsc-oenramp1细胞生长较对照组变快，其群体倍增时间较对照组显著缩短为0.9973 天。而在raw264.7细胞中过表达山羊nramp1，其并不影响细胞增殖。有趣的是，利用沙门氏菌的lps在200ng/ml分别刺激raw-pcdh和raw-nramp1, 结果表明过表达nramp1的raw264.7能够减少沙门氏菌lps引起的细胞凋亡率(图2a)。rna-seq分析结果显示(图2b)：在mgsc-oenramp1细胞株中，其差异基因总计3353个，上调基因2021个，下调基因1532个。火山图显示slc11a1(nramp1)mrna水平较对照组上调了27.5倍，即181倍。go富集分析结果显示上调基因大部分富集到了抗病毒、应对病毒反应过程、抗原呈递、宿主防御等生物学过程，表明过表达nramp1能够提高mgscs细胞的免疫应答能力。

18、除此之外热图中展示的stat1、stat2、irf9、stat6、socs1、socs2、isg15、isg20属于jak-stat通路，该通路是许多调节细胞生长、分化、存活和病原体抵抗信号通路中的关键部分，其在应激炎症中也起到了关键作用。有趣的是：il6、il-12a、il-12b、il-1b这些促进炎症的细胞因子mrna水平被下调，这种现象可能是过表达细胞通过在mrna水平降低炎症因子，使细胞在面对病原刺激时免受炎症带来的负面影响。

19、综上的结果表明：mgsc-oenramp1细胞能够增加细胞对病原的免疫能力的同时，又减轻了炎症反应所带来的负面影响，这对研究病原菌与宿主互作提供了良好的平台。

20、五、构建山羊nramp1过表达细胞株有以下优势

21、1) 发明创新性强，nramp1是溶质转运家族成员，也被称作溶质转运载体(solutecarrier 11a1, slc11a1)，在小鼠巨噬细胞中对抵抗病原体起着关键性作用，然而有很少的研究就其调控机制进行报道，本发明通过构建过表达山羊nramp1细胞系，为后续探索研究其机制提供可靠平台，同时为抗病育种工作奠定基础。

22、2) 从实际的数据来看，在mgsc细胞中，过表达山羊nramp1，能够提高细胞的免疫应答能力，特别是对jak-stat通路的影响。同时降低细胞内炎症因子的表达水平。

23、3) 从实际的数据来看，在raw264.7细胞中，过表达山羊nramp1，在沙门氏菌lps刺激下，其凋亡水平较对照组显著下降，能够挽救细胞的炎症反应。

24、综上所述，构建过表达山羊nramp1细胞系，对于探究胞内菌与宿主互作效应，以及胞内相应病原刺激的相关通路来说，是一个良好的研究平台，为将来生产具有优良性状的抗病山羊等疾病模型奠定了基础。