利用熔解曲线检测水稻GW3p6基因的功能标记及方法

本发明属于农业生物，具体涉及一种利用熔解曲线检测水稻gw3p6基因的功能标记及方法。

背景技术：

1、粒型是决定水稻产量及品质的关键性状之一，具有重要的应用价值。gw3p6/oslg3b/qlgy3基因为一个控制水稻粒型和产量的重要基因。该基因为一个编码含mads结构域的转录因子osmads1，是g蛋白βγ二聚体下游的关键效应子。其最后一个外显子边界区一段15碱基序列5’-tccttcaccaagga-3’突变为13个碱基的序列5’-agtatatatacat-3’，导致剪接位点发生改变。突变基因型会导致水稻粒型细长，提高稻谷的品质和产量。近等基因系粒长和千粒重提高6～7％，单株产量提高8％，除此之外其它农艺性状无变化。将gw3p6基因聚合了另一个控制穗数的杂种优势基因rn3q23后的fuhui676谷物产量增加15％，这两个基因可以解释40％的杂种优势。韩斌院士课题组鉴定了1328份杂交水稻，其中仅约11.5％的两系杂交稻、1.6％的三系杂交稻中含有长粒型基因(wangetal,nature communication,2019,10:2982)。进化分析表明长粒突变源自热带粳稻，通过天然杂交和人工选择扩散到籼稻和温带粳稻中。目前仅少量的现代籼稻和温带粳稻品种含有长粒基因型(yu etal,plantbiotechnologyjournal,2018,16:1667–1678)。因此qlgy3/oslg3b/gw3p6的长粒基因型在水稻遗传育种中有很大的应用潜力。

2、为促进gw3p6基因在水稻遗传改良中的应用，扬州大学张林等开发了针对该位点caps标记(申请号201911112386.4)，但这种检测方式需要在pcr后再利用限制性酶切后电泳，价格较为昂贵，操作繁琐，难以高效地对大样本进行大规模的基因型分析。因此需要建立一种简易、廉价、快速准确的基因分型体系。高分辨熔解曲线(high-resolutionmelting,hrm)是一种新兴的突变检测及基因分型技术。dna序列的长度，gc碱基含量及碱基的分布方式等都会影响到双链dna的解链或熔解过程。hrm检测是基于dna分子的物理特性进行分析，无需设计特异探针或接头，仅仅在常规pcr反应体系中加入饱和染料即可。操作过程简单，成本低廉并且可以闭管操作，是进行基因型分析的有力手段。但hrm对检测仪器的温度及均一性控制要求较高，如目前已停产的专用于hrm检测的lightscanner，以及部分高端集成了qpcr和hrm检测功能的lightcycler480，rotor-geneq和quantstudioq6等。但大部分实验室的常规定量pcr仪仅具有普通熔解曲线及tm值检测功能，不能用于hrm基因分型，限制了hrm技术的应用。因此针对gw3p6基因开发基于熔解温度的分子标记具有重要的意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用熔解曲线检测水稻gw3p6基因的功能标记及方法，所述功能标记是针对水稻粒型及产量基因gw3p6最后一个外显子边界区一段15碱基序列5’-tccttcaccaagga-3’突变为5’-agtatatatacat-3’的多态位点而开发的。

2、本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

3、一种利用熔解曲线检测水稻gw3p6基因的功能标记，所述功能标记由如下两条引物构成：gw3p6-f：5’-tgatggtgagcatgagggtg-3’，

4、gw3p6-r：5’-atactccatcattttcatagc-3’。

5、上述一种功能标记在鉴定水稻gw3p6基因型中的应用。

6、上述一种功能标记在水稻粒型遗传改良中的应用。

7、一种利用熔解曲线鉴定水稻gw3p6基因型的方法，其是用如下两条引物对水稻gw3p6基因型进行检测，所述两条引物为：

8、gw3p6-f：5’-tgatggtgagcatgagggtg-3’，

9、gw3p6-r：5’-atactccatcattttcatagc-3’。

10、进一步的，上述一种利用熔解曲线鉴定水稻gw3p6基因型的方法具体步骤如下：

11、1)提取待测水稻样品dna；

12、2)利用引物gw3p6-f和gw3p6-r，以步骤1)提取的待测水稻样品dna为模板，进行pcr扩增反应获得扩增产物：

13、3)以步骤2)获得的扩增产物进行熔解曲线分析，从而鉴定待测水稻样品gw3p6基因型。

14、进一步的，上述pcr的扩增体系为：10×pcrbuffer1μl，2.5mmeachdntp0.8μl，10μm的gw3p6-f和gw3p6-r各0.1μl，5u/μltakarataq0.1μl，20×evagreen0.2μl，20～50ng/μl温度内标dna1μl，20～100ng/μl待测待测水稻样品dna1μl，加dh2o补液至10μl。

15、进一步的，上述pcr的扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共33个循环；72℃延伸5min。

16、进一步的，上述熔解曲线分析中，当熔解曲线为单峰且熔解温度范围为73.82～74.57℃，则待测水稻样品判断为gw3p6基因野生型，谷粒粒长、粒宽、长宽比及千粒重较小；当熔解曲线为单峰且熔解温度范围为70.99～71.42℃，则待测水稻样品判断为gw3p6基因突变型，谷粒粒长、粒宽、长宽比及千粒重较大；当熔解曲线有双峰，且熔解温度范围分别为73.82～74.57℃和70.99～71.42℃，则待测水稻样品判断为gw3p6基因杂合型，谷粒粒长、粒宽、长宽比及千粒重处于野生型和突变型之间。

17、进一步的，上述温度内标dna的碱基序列如seq id no.3所示。

18、进一步的，上述温度内标dna是以质粒pcambia1300为模板，利用正向引物90f和反向引物90r进行扩增得到；所述正向引物90f和反向引物90r为：

19、90f：5’-gagttggtcaagaccaatgc-3’，

20、90r：5’-aggctctcgatgagctgatg-3’。

21、本发明相对于已有技术的优点在于：

22、1)避免了凝胶电泳或酶切的缺陷，实现了自动化及全闭管状态下的基因型检测，高效且成本低廉；

23、2)与现有高分辨熔解曲线技术相比，本发明利用普通定量pcr仪的熔解温度功能即可检测水稻gw3p6基因的基因型，在保留了高分辨熔解曲线分型方法优点的同时，降低了高分辨熔解曲线分型方法对检测设备的要求，使得更多的实验室或研究机构可以利用此技术。本发明设计的引物在不同等位基因间熔解温度差异大，野生型(短粒型)片段核苷酸序列中片段长度74bp及35.14％的gc含量均高于突变型(长粒型)基因片段的长度72bp及29.17％的gc含量，导致野生型(短粒型)扩增片段的熔解温度较突变型(长粒型)高，长粒型和短粒型基因型的熔解温度图呈现为两个明显独立的峰，可以明确区分长粒型、短粒型及杂合型等不同基因型。

24、因此，本发明所提供的利用熔解温度检测水稻粒型基因gw3p6的分子标记引物，以及利用此引物检测gw3p6基因型的方法在生产实践中具有广泛的利用前景，利用此标记可以提高gw3p6基因在水稻分子标记辅助选择效率。