一种分泌热休克转录因子突变体的重组毕赤酵母及其构建方法和应用与流程

本发明涉及基因工程，特别是涉及一种分泌热休克转录因子突变体的重组毕赤酵母及其构建方法和应用。

背景技术：

1、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)是一种甲醇营养型酵母，毕赤酵母表达体系是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统之一。大量的研究表明毕赤酵母具有以下几个特点：①分子遗传操作相对简单，重组菌株较稳定；②具有强诱导的启动子aox1，在甲醇诱导下外源蛋白表达量高；③容易实现高密度培养(>130g·l-1)；④营养要求低，生长快，培养基价格低廉；⑤适度的蛋白折叠、翻译后修饰和糖基化，适用于药用蛋白的生产及稳定性的提高。目前已有数百种外源蛋白实现了在毕赤酵母中的高效表达，蛋白的表达量高达几到十几g·l-1水平，许多毕赤酵母表达的外源蛋白已实现了工业化生产，如木聚糖酶、脂肪酶和人生长激素等。除了广泛地应用于生产工业及药用蛋白，毕赤酵母还被作为模式生物用于分析过氧化物酶体的合成以及研究外源蛋白的表达和分泌机理。要实现外源蛋白在毕赤酵母中的高效分泌表达必须根据基因本身的特性进行合理的设计才能获得，大量研究证明，内质网中蛋白的折叠压力是外源蛋白分泌的主要限速步骤。缓解内质网压力对于提高外源蛋白分泌表达具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术中存在的内质网中蛋白的折叠压力时外源蛋白分泌的限速，而提供一种分泌热休克转录因子突变体的重组毕赤酵母。

2、本发明的另一目的，提供一种所述重组毕赤酵母的构建方法。

3、本发明的另一目的，提供一种所述重组毕赤酵母的应用。

4、为实现本发明的目的所采用的技术方案是：

5、一种分泌热休克转录因子突变体的重组毕赤酵母(pichia pastoris)，热休克转录因子来源于酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，所述热休克转录因子突变体为突变体hsf1r206s，所述突变体hsf1r206s为热休克转录因子1hsf1的第206位的精氨酸突变为丝氨酸的突变体。

6、在上述技术方案中，所述重组毕赤酵母保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏号：cgmcc no.36937，保藏日期：2023年3月28日。

7、在上述技术方案中，所述突变体hsf1r206s的氨基酸序列如seq no.2所示。

8、在上述技术方案中，表达所述突变体hsf1r206s的dna序列如seq no.1所示。

9、在上述技术方案中，所述突变体hsf1r206s的dna通过构建表达载体ppicza-hsf1r206s线性化转化入毕赤酵母，优选的，所述突变体hsf1r206s的dna及其调节基因构成的表达盒整合到毕赤酵母的基因组中。

10、在上述技术方案中，所述重组毕赤酵母通过以下方法构建：

11、将表达载体ppicza-hsf1r206s经单酶切线性化并纯化后电转化毕赤酵母感受态细胞，然后进行阳性转化子筛选。

12、在上述技术方案中，所述表达载体ppicza-hsf1r206s通过以下方法构建：

13、步骤1，将hsf1的618位点的碱基g突变碱基c，设计引物hsf1-s和hsf-r206s-a与hsf-r206s-s和hsf1-a；

14、步骤2，以酿酒酵母基因组作为模板，引物hsf1-s和hsf-r206s-a与hsf-r206s-s和hsf1-a扩增hsf1基因的上下部分，以胶回收纯化后的pcr产物为模板，以引物hsf1-s和hsf1-a通过pcr扩增hsf1r206s基因；

15、步骤3，培养大肠杆菌菌株ppicza、收集细胞，分离、提取质粒ppicza，用连接酶将步骤2得到的模板进行双酶切与同样经过相同内切酶双酶切的质粒ppicza连接，连接产物化学转化大肠杆菌e.coli top10，平板筛选阳性转化子，阳性转化子提取鉴定正确的质粒，得到重组质粒ppicza-hsf1r206s。

16、本发明的另一方面，提供一种所述的重组毕赤酵母的构建方法，其特征在于，所述突变体hsf1r206s的dna通过构建表达载体ppicza-hsf1r206s线性化转化入毕赤酵母，优选的，所述突变体hsf1r206s的dna及其调节基因构成的表达盒整合到毕赤酵母的基因组中；

17、更优选的，所述重组毕赤酵母通过以下方法构建：

18、将表达载体ppicza-hsf1r206s经单酶切线性化并纯化后电转化毕赤酵母感受态细胞，并进行阳性转化子筛选；

19、优选的，所述表达载体ppicza-hsf1r206s通过以下方法构建：

20、步骤1，将hsf1的618位点的碱基g突变碱基c，设计引物hsf1-s和hsf-r206s-a与hsf-r206s-s和hsf1-a；

21、步骤2，以酿酒酵母基因组作为模板，引物hsf1-s和hsf-r206s-a与hsf-r206s-s和hsf1-a扩增hsf1基因的上下部分，以胶回收纯化后的pcr产物为模板，以引物hsf1-s和hsf1-a通过pcr扩增hsf1r206s基因；

22、步骤3，培养大肠杆菌菌株ppicza、收集细胞，分离、提取质粒ppicza，用连接酶将步骤2得到的模板进行双酶切与同样经过相同内切酶双酶切的质粒ppicza连接，连接产物化学转化大肠杆菌e.coli top10，平板筛选阳性转化子，阳性转化子提取鉴定正确的质粒，得到重组质粒ppicza-hsf1r206s。

23、本发明的另一方面，提供一种所述的重组毕赤酵母在生产分泌型外源蛋白中的应用。

24、在上述技术方案中，所述分泌型外源蛋白为木聚糖酶。

25、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

26、热应激反应(hsr)已经被证实可以缓解内质网压力。在酿酒酵母中，hsr是由热休克转录因子1hsf1调节的，通过下游的效应途径(如蛋白折叠、蛋白运输、能量降解、细胞信号传递等)缓解内质网压力，在这些途径中，超过25％的蛋白在蛋白分泌途径中有着作用。hsf1的突变体，第206位的精氨酸突变为丝氨酸的突变体hsf1r206s，可以在胞内激活热应激反应而不需要环境或细胞的温度变化。在此基础上，本发明的重组毕赤酵母可以提高外源蛋白表达量，有利于毕赤酵母作为酶制剂生产菌株的广发应用，具体的，本发明的重组毕赤酵母在生产木聚糖酶时，相对于原菌种，木聚糖酶的酶活力增加32％，蛋白浓度增加41％。

技术特征：

1.一种分泌热休克转录因子突变体的重组毕赤酵母(pichia pastoris)，其特征在于，热休克转录因子来源于酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，所述热休克转录因子突变体为突变体hsf1r206s，所述突变体hsf1r206s为热休克转录因子1hsf1的第206位的精氨酸突变为丝氨酸的突变体。

2.如权利要求1所述的分泌热休克转录因子突变体的重组毕赤酵母，其特征在于，所述重组毕赤酵母保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：cgmcc no.26937，保藏日期：2023年3月28日。

3.如权利要求1所述的分泌热休克转录因子突变体的重组毕赤酵母，其特征在于，所述突变体hsf1r206s的氨基酸序列如seq no.2所示。

4.如权利要求3所述的分泌热休克转录因子突变体的重组毕赤酵母，其特征在于，表达所述突变体hsf1r206s的dna序列如seq no.1所示。

5.如权利要求4所述的分泌热休克转录因子突变体的重组毕赤酵母，其特征在于，所述突变体hsf1r206s的dna通过构建表达载体ppicza-hsf1r206s线性化转化入毕赤酵母，优选的，所述突变体hsf1r206s的dna及其调节基因构成的表达盒整合到毕赤酵母的基因组中。

6.如权利要求5所述的分泌热休克转录因子突变体的重组毕赤酵母，其特征在于，所述重组毕赤酵母通过以下方法构建：

7.如权利要求5所述的分泌热休克转录因子突变体的重组毕赤酵母，其特征在于，所述表达载体ppicza-hsf1r206s通过以下方法构建：

8.一种如权利要求1-7任意一项所述的重组毕赤酵母的构建方法，其特征在于，所述突变体hsf1r206s的dna通过构建表达载体ppicza-hsf1r206s线性化转化入毕赤酵母，优选的，所述突变体hsf1r206s的dna及其调节基因构成的表达盒整合到毕赤酵母的基因组中；

9.一种如权利要求1-7任意一项所述的重组毕赤酵母在生产分泌型外源蛋白中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述分泌型外源蛋白为木聚糖酶。

技术总结
本发明公开了一种分泌热休克转录因子突变体的重组毕赤酵母及其构建方法和应用，热休克转录因子来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，所述热休克转录因子突变体为突变体Hsf1<supgt;R206S</supgt;，所述突变体Hsf1<supgt;R206S</supgt;为热休克转录因子1Hsf1的第206位的精氨酸突变为丝氨酸的突变体。本发明的重组毕赤酵母可以提高外源蛋白表达量，有利于毕赤酵母作为酶制剂生产菌株的广发应用，具体的，本发明的重组毕赤酵母在生产木聚糖酶时，相对于原菌种，木聚糖酶的酶活力增加32％，蛋白浓度增加41％。

技术研发人员：李承,姜睿康,薛怡芸,李振,张天元
受保护的技术使用者：苏州聚维元创生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14