一种快速检测人腺病毒14型的引物、探针及试剂盒的制作方法

本发明属于生物检测，尤其涉及一种快速检测人腺病毒14型的引物、探针及试剂盒。

背景技术：

1、人腺病毒(hadv)是双链无包膜dna病毒，具有高度传染性，可在人群中引起广泛的疾病，如急性呼吸道感染、急性胃肠炎、流行性角膜结肠炎和泌尿生殖系统疾病等。hadv分为7个亚组(hadv-a至hadv-g)，包括100多种血清型，不同的hadv血清型会引起不同的临床综合征，在这些血清型中，hadv-b种病毒(hadv-3、-7、-11、-14、-55)和hadv-e(hadv-4)是导致呼吸道感染的主要病原体，开发快速、灵敏、特异的hadv-14诊断方法及时诊断hadv-14，对于控制hadv-14感染至关重要。

2、目前针对hadv的检测方法主要包括病毒分离培养法、血清学检测和分子生物学检测。病毒分离法是通过观察特征性细胞致病作用(cpe)来检测腺病毒，被认为是诊断腺病毒的“金标准”，但其培养细胞耗时较长，对技术水平要求较高，不能满足临床快速诊断的需求，也不适用于现场的疾病快速诊断；血清学检测对设备等要求条件较低，可以快速检测出病毒，但该方法依赖于特异性抗体，稳定性差且灵敏度低；随着分子诊断技术的发展，以聚合酶链反应(pcr)为基础的变温扩增技术(如pcr、实时荧光定量pcr、巢式pcr等)已经成为检测腺病毒感染的常用工具，这些方法具有灵敏度高、特异强等优点，即便核酸含量较少也能检测，但其操作过程繁琐，它们需要热循环仪和训练有素的操作人员，难以在缺乏精密仪器设备、医疗资源相对有限的地区和医院实现；与以聚合酶链反应(pcr)为基础的变温扩增技术相比，核酸等温扩增方法简单、快速且具有成本效益，重组酶介导等温扩增技术(recombinase aided amplification，raa)是一种新型的等温核酸扩增技术，包含三种重要的蛋白质：重组酶、单链dna结合蛋白和dna聚合酶，在raa过程中，反应体系中的重组酶与引物结合形成复合物，在dna模板中寻找同源序列，一旦同源序列定位，发生链交换反应，ssb与单链dna结合稳定dna单链，dna聚合酶启动dna扩增，raa可在恒定温度下，5-30分钟完成基因扩增，与pcr相比，该过程不需要高温变性或低温退火，反应简单、快速、高效。

3、申请号为201910029711.4的中国专利公开了一种基于raa荧光法快速检测呼吸道腺病毒的引物、探针及检测试剂盒，能够准确地检测出呼吸道腺病毒，操作方便，检测时间短。但是该方法只能检测出呼吸道腺病毒，却不能对呼吸道腺病毒进行分型，无法确定患者感染的是哪种亚型腺病毒。

4、鉴于现存的hadv-14病毒检测方法的不足以满足hadv-14病毒快速现场检测的需求，因此研究一种能在基层应用、可在常温下快速检测hadv-14病毒的扩增方法非常有必要。

技术实现思路

1、本发明实施例的目的在于提供一种快速检测人腺病毒14型的引物，旨在解决上述背景技术中提出的问题。

2、本发明实施例是这样实现的，一种快速检测人腺病毒14型的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为gcgaacagatagttacaaggagattcagtt(如seq id no.1所示)；所述下游引物的核苷酸序列为gagatacagagccacattggaataaaggaa(如seq id no.2所示)。

3、本发明实施例的另一目的在于提供一种快速检测人腺病毒14型的探针，所述探针的核苷酸序列为gagaccaagcttggaaagatgtaaatccaaa[fam-dt][thf]g[bhq1-dt]atcagtgaacttgttaag[c3spacer](如seq id no.3所示)。

4、本发明实施例的另一目的在于提供一种快速检测人腺病毒14型的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物和如上述探针。

5、优选地，所述试剂盒还包括缓冲液。

6、本发明实施例的另一目的在于提供一种上述试剂盒在基于raa荧光法快速检测人腺病毒14型中的应用。

7、本发明实施例针对hadv-14的hexon基因设计特异性引物和探针，具有较好的灵敏性和特异性，其能够配合raa技术对待测样品中是否含有14型腺病毒进行快速、准确的检测，实现了对14型腺病毒进行准确、快速、灵敏、方便、高通量的快速检测，可在40℃条件下30分钟内完成实验，可检出低至101copies/μl的hadv-14，为hadv-14的临床诊断或现场评估提供了新的方法，弥补了现有传统检测技术的不足，非常适用于现场快速检测，与传统pcr法相比raa法是在恒温下反应，操作简单，摆脱了复杂仪器的束缚，大大缩短了反应时间，非常适用于资源有限地区的现场检测。

技术特征：

1.一种快速检测人腺病毒14型的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列为gcgaacagatagttacaaggagattcagtt；所述下游引物的核苷酸序列为gagatacagagccacattggaataaaggaa。

2.一种快速检测人腺病毒14型的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为gagaccaagcttggaaagatgtaaatccaaa[fam-dt][thf]g[bhq1-dt]atcagtgaacttgttaag[c3spacer]。

3.一种快速检测人腺病毒14型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物和如权利要求2所述的探针。

4.根据权利要求3所述的快速检测人腺病毒14型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括缓冲液。

5.一种如权利要求3或4所述的试剂盒在基于raa荧光法快速检测人腺病毒14型中的应用。

技术总结
本发明适用于生物检测技术领域，提供了一种快速检测人腺病毒14型的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为如SEQ IDNo.1所示；所述下游引物的核苷酸序列为如SEQ ID No.2所示。本发明还提供一种快速检测人腺病毒14型的探针，所述探针的核苷酸序列为如SEQ ID No.3所示。本发明还提供一种快速检测人腺病毒14型的试剂盒，包括上述引物和上述探针。本发明实施例还提供一种上述试剂盒在基于RAA荧光法快速检测人腺病毒14型中的应用。本发明有较好的灵敏性和特异性，其能够配合RAA技术实现了对14型腺病毒进行准确、快速、灵敏、方便、高通量的快速检测。

技术研发人员：戴玉柱,成军,孙青阳,车飞虎,王月,陈鸿斌,杨春利,周华君
受保护的技术使用者：中国人民解放军联勤保障部队第九〇三医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14