甲醛重交联在CUT&Tag技术建库中的应用的制作方法

本发明属于生物。具体地，涉及甲醛重交联在cut＆tag技术建库中的应用。

背景技术：

1、在胚胎的正常发育过程中，携带相同遗传物质的受精卵会分化成不同形态的细胞，最终形成具有不同组织和器官的完整生物体。研究表明，这种不涉及遗传物质改变的分化是通过表观遗传调控实现的。表观遗传调控通常包括基因调控和染色质调控，这些调控过程与蛋白质-dna相互作用息息相关。由表观遗传学控制的基因表达模式的破坏会导致自身免疫性疾病、癌症等各种疾病。因此，研究蛋白质-dna之间的相互作用对于理解疾病发生具有至关重要的意义。

2、目前，研究蛋白质-dna相互作用的方法主要有：染色质免疫共沉淀(chromatinimmunoprecipitation,chip)、cut＆run、和cut＆tag((cleavage under targets andtagmentation))技术。其中，cut＆tag技术使用细胞或细胞核进行实验，无需交联固定细胞(或采用0.1～0.2％甲醛、2～3min的轻交联)，通过protein a/protein g-tn5转座酶实现靶向打断。具有细胞需求量少(1～10万细胞)、耗时短(8～10小时)、背景噪音低、实验简单等特点。

3、然而，在大量实践中，科研工作者发现cut＆tag技术存在局限性。对于一些与dna的结合具有动态性的dna结合蛋白的相互作用检测，cut＆tag技术中不交联或轻交联(0.1％～0.2％甲醛)的方法，难以真实反映实验样本的客观情况。此外也存在结合位点信号强度较弱、背景较高的问题。

4、综上所述，cut＆tag技术面临着巨大挑战。如何使cut＆tag适用于大部分蛋白质-dna相互作用，同时保持cut＆tag技术简单快捷的特点，是亟待解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种甲醛重交联在cut＆tag技术建库中的应用。

2、本发明的目的在于还提供一种靶蛋白固定及其dna结合图谱鉴定的建库方法。

3、本发明的目的在于还提供一种针对与dna结合力弱或与dna的结合具有高度动态性的dna结合蛋白的dna结合图谱鉴定的建库方法。

4、在本发明的第一方面，提供了一种构建核酸文库的方法，包括：

5、(s1)提供一细胞样本；

6、(s2)通过终浓度c1(v/v)的交联剂溶液，固定化处理上述细胞样本t1时间(min)，其中固定化处理积分i1＝c1*t1，i1≥2.5，获得一未通透化的细胞样本；

7、(s3)对所述未通透化的细胞样本进行通透化处理，获得经通透化处理的细胞样本；

8、(s4)洗涤上述经通透化处理的细胞样本，获得经洗涤的细胞混合物；

9、(s5)将上述细胞混合物与已经预处理的磁珠混合，获得细胞-磁珠复合物；

10、(s6)利用一抗处理上述的细胞-磁珠结合物，获得一抗-细胞-磁珠复合物；

11、(s7)利用二抗处理上述一抗-细胞-磁珠复合物，获得二抗-一抗-细胞-磁珠复合物；

12、(s8)利用转座酶处理上述二抗-一抗-细胞-磁珠复合物，进行片段化反应，形成dna片段；

13、(s9)终止反应并解交联，获得反应终止产物；和

14、(s10)分离、纯化、扩增上述反应终止产物中的dna片段，制备核酸文库。

15、在另一优选例中，(s1)中，所述细胞包括动物细胞，较佳地为哺乳动物细胞，更佳地为仓鼠细胞、人类细胞或小鼠细胞。

16、在另一优选例中，(s1)中，所述细胞样本中的细胞密度为1×103～5×106个/ml。

17、在另一优选例中，(s2)中，c1为0.5％～5％(v/v)；较佳地为1％～3％(v/v)。

18、在另一优选例中，(s2)中，t1为5～60min；较佳地为10～20min。

19、在另一优选例中，(s2)中，i1为2.5～300；较佳地i1≥10。

20、在另一优选例中，(s2)中，所述固定化处理为充分固定化处理，指所有或基本上所有的细胞被交联固定；其中，“所有或基本上所有”，是指有≥85％；较佳地≥90％；较佳地≥95％；更佳地≥98％；最佳地≥99％的细胞被交联固定。

21、在另一优选例中，(s2)中，所述交联剂包括但不限于甲醛、egs、dsg，较佳地为甲醛。

22、在另一优选例中，(s2)中，所述固定化处理包括：

23、(s2.1)按照3×103～3×106个/ml的细胞密度向(s1)中的细胞样本加入相应体积的0.5％～5％甲醛交联剂溶液，室温孵育5～60min；

24、(s2.2)通过终浓度125～1000mm甘氨酸终止反应，终止时间5～15min。

25、在另一优选例中，(s2)中，所述通透缓冲液包括pb、tris、hepes缓冲液。

26、在另一优选例中，(s2)中，所述通透剂选自下组中的一种或多种：tween20、sds、np40(或igepal ca-630)、digtonin、chaps、脱氧胆酸钠、或其组合；优选为tween20、sds或np40(或igepal ca-630)。

27、在另一优选例中，(s3)中，所述通透缓冲液包括选自下组中的一种或多种：

28、0.1％-0.5％(v/v)，较佳地0.2％(v/v)np40,

29、0.1％-0.5％(v/v)，较佳地0.1％(v/v)sds,

30、0.1％-0.5％(v/v)，较佳地0.1％(v/v)tween20,

31、0.01％-0.2％(v/v)，较佳地0.05％(v/v)digitonin,

32、0.1％-0.5％(v/v)，较佳地0.1％(v/v)trinonx-100,

33、0.1％-0.5％(v/v)，较佳地0.1％(v/v)chaps。

34、在另一优选例中，(s3)中，所述通透化处理包括：通过包含c2(v/v)通透剂的通透缓冲液，通透化处理上述经固定化处理的细胞样本t2时间(min)，获得经通透化处理的细胞样本。

35、在另一优选例中，(s3)中，c2为0.005％～5％；较佳地为0.01％～2％。

36、在另一优选例中，(s3)中，t2为5～60min。

37、在另一优选例中，(s3)中，细胞通透处理的细胞密度为3×103～3×106个/ml。

38、在另一优选例中，(s3)中，通透处理温度为45～68℃。

39、在另一优选例中，(s3)中，所述通透缓冲液的ph值为7.0～7.8；较佳地为7.2～7.6。

40、在另一优选例中，(s3)中，所述通透缓冲液含100～200mm nacl或其他具有同等电导强度的盐。

41、在另一优选例中，(s3)中，所述通透化处理包括：利用通透缓冲液处理经固定化处理的细胞样本，在55～65℃温控仪器中孵育5～20min。

42、在另一优选例中，(s4)中，所述洗涤包括：加入细胞洗涤缓冲液，孵育20～50min后，离心除去上清。

43、在另一优选例中，(s4)中，所述细胞洗涤缓冲液为含0.01％～0.1％(v/v)通透剂的缓冲液。

44、在另一优选例中，(s4)中，所述细胞洗涤缓冲液包含选自下组的一种或多种通透剂：

45、0.1％-0.5％(v/v)，较佳地0.15％(v/v)tween20,

46、0.1％-0.5％(v/v)，较佳地0.15％(v/v)np40，

47、0.01％-0.2％(v/v)，较佳地0.01％(v/v)digitonin,

48、0.1％-0.5％(v/v)，较佳地0.1％(v/v)tritonx-100。

49、在另一优选例中，(s5)中，所述磁珠为cona磁珠。

50、在另一优选例中，(s6)中，所述一抗孵育时间为1～16h。

51、在另一优选例中，(s8)中，所述转座酶选自：pa-tn5、pg-tn5、pa-pg-tn5；较佳地为pa/g-tn5(protein a-tn5)。

52、在另一优选例中，(s8)中，所述转座酶的孵育打断时间为0.5～3h。

53、在另一优选例中，(s9)中，所述终止反应并解交联包括：加入解交联试剂进行孵育。

54、在另一优选例中，(s9)中，所述解交联试剂包括：2-10μl 0.5m edta；1-8μl 10％sds；0.2-5μl 20mg/ml的蛋白酶k。

55、在另一优选例中，(s9)中，所述解交联温度为50～60℃；所述解交联时间为0.5～12h。

56、在本发明的第二方面，提供了一种利用cut＆tag技术构建核酸文库的试剂盒，包括：

57、(1)交联剂溶液；

58、(2)通透缓冲液；

59、(3)细胞洗涤缓冲液；

60、(4)片段化反应试剂；和

61、(5)解交联试剂。

62、在另一优选例中，所述交联剂包括但不限于甲醛、egs、dsg，较佳地为甲醛。

63、在另一优选例中，所述交联剂的浓度c1％为0.5％～5％；较佳地为1％～3％。

64、在另一优选例中，所述通透缓冲液包括pb、tris、hepes缓冲液。

65、在另一优选例中，所述通透缓冲液的ph值为7.0～7.8；较佳地为7.2～7.6。

66、在另一优选例中，所述通透缓冲液含50～150mm nacl或其他具有同等电导强度的盐。

67、在另一优选例中，所述通透缓冲液还含有细胞蛋白保护剂，所述细胞蛋白保护剂为1～100mm glycine、0.1％～2％(v/v)bsa，或其他类似物。

68、在另一优选例中，所述通透缓冲液包含通透剂，所述通透剂选自下组：tween20、sds、np40、digtonin、chaps、脱氧胆酸钠、或其组合；优选为tween20、sds或np40。

69、在另一优选例中，所述通透缓冲液包括选自下组中的一种或多种：

70、0.1％-0.5％(v/v)，较佳地0.2％(v/v)的np40,

71、0.1％-0.5％(v/v)，较佳地0.1％(v/v)的sds,

72、0.1％-0.5％(v/v)，较佳地0.1％(v/v)的tween20,

73、0.01％-0.2％(v/v)，较佳地0.05％(v/v)的digitonin,

74、0.1％-0.5％(v/v)，较佳地0.1％(v/v)的trinonx-100,

75、0.1％-0.5％(v/v)，较佳地0.1％(v/v)的chaps。

76、在另一优选例中，所述通透剂的浓度c2为0.005％～5％；较佳地为0.01％～2％。

77、在另一优选例中，所述细胞洗涤缓冲液为含0.01％～0.1％通透剂的缓冲液。

78、在另一优选例中，所述细胞洗涤缓冲液包含的通透剂选自下组：tween20、tritonx100、sds、np40、digtonin、或其组合。

79、在另一优选例中，所述细胞洗涤缓冲液的ph值为7.2～7.6。

80、在另一优选例中，所述细胞洗涤缓冲液含100～150mm nacl或其他具有同等电导强度的盐。

81、在另一优选例中，所述片段化反应通过转座酶进行，所述转座酶选自下组：pa/g-tn5、protein a-tn5、protein g-tn5、protein a-protein g-tn5或其组合。

82、在另一优选例中，所述片段化反应试剂，包括不限于转座酶、磁珠、一抗、二抗。

83、在另一优选例中，所述试剂盒还包括解交联试剂、反应终止试剂、或用于pcr扩增的试剂。

84、在另一优选例中，所述解交联试剂包括：2-10μl 0.5m edta；1-8μl 10％ sds；0.2-5μl 20mg/ml的蛋白酶k。

85、在本发明的第三方面，提供了一种测量蛋白质-染色质相互作用的方法，包括：

86、(s1)利用如权利要求1所述的方法构建核酸文库；和

87、(s2)对核酸文库进行测序，以产生用于测量蛋白质-染色质相互作用的多个测序读数。

88、在另一优选例中，所述蛋白质包括对dna结合力弱或与dna的结合具有高度动态性的dna结合蛋白。

89、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。