一种快速筛选可诱导白木香结香真菌的方法

本发明涉及结香，特别涉及一种快速筛选可诱导白木香结香真菌的方法。

背景技术：

1、白木香为瑞香科常绿乔木，是国产沉香的重要资源植物，也是我国特有的珍贵药用植物。由于长期过度开采，白木香野生资源日渐枯竭，已被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(cites)附录ⅱ。沉香为白木香受伤后产生的含树脂木材，是我国传统名贵药材和贵细香料。其味辛、苦，性微温，具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘功效，用于治疗胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘急等病证。沉香主要成分为倍半萜类、2-(2-苯乙基)色酮类、芳香族类、脂肪酸类、三萜类等，其中2-(2-苯乙基)色酮类化合物是沉香的主要活性成分和特征性成分，生物学和药理学研究表明该类化合物具有神经保护、抗炎、细胞毒等多种生物活性。

2、健康的白木香无法结香，只有在受到如虫蛀、真菌侵染等外界伤害时，白木香由于自身的防御机制分泌次生代谢物堵塞次生木质部的维管束和导管，从而抵御进一步损伤，次生代谢物经过多年积累即在伤口周围形成一层黑褐色的树脂，即为沉香。近年来，人工结香方法主要分为物理伤害法、化学法和生物法。物理伤害法包括半断干、火烙、砍伤、剥皮、钻洞、钉孔等，通过造成树体物理性的损伤形成沉香，这种方法仅在伤口附近形成沉香且结香时间较长。化学法是指采用植物激素、盐、矿物质、甲酸、结香液等处理树体，让树体快速结香的方法。生物法主要借助微生物等对树体进行处理，其中人工接菌法安全环保，且所结沉香品质接近于野生沉香。

3、真菌种类繁多、功能各不相同，但是并非所有菌株都可诱导白木香结香。可用于诱导的菌株中其诱导结香的能力也不同，有些可以快速诱导沉香形成，有些需要通过缓慢感染以诱导沉香形成。课题组前期以白木香通体结香技术(zl201010104119.5)，将菌液通过输液装置输入白木香树体，利用植物的蒸腾作用，疏导至植物茎干、枝条、根等各器官，促使整个植株内部结香。该方法虽然可用于接菌结香，但存在输液时间长、菌丝体堵塞输液管、操作繁琐、受天气因素制约等问题，无法用于前期快速筛选出可诱导结香的菌株。因此，找到一种方便快捷的方法，以便在众多真菌菌株中快速筛选出可诱导结香的菌株具有重要意义。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明的目的在于提出一种快速筛选可诱导白木香结香真菌菌株的方法，在安全操作情况下，向白木香树干注射少量菌液，以便真菌感染白木香以激发防御反应，从而诱导白木香在短时间内累积次生代谢物，通过观察注射部分木质部的颜色变化以快速判断该菌株是否具有诱导结香的能力。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、一种快速筛选可诱导白木香结香真菌的方法，包括如下步骤：

4、s1接种材料的准备：选取真菌接种至促生液体培养基中，振荡培养，过滤，得菌液；

5、s2白木香树干的处理：在离地至少20cm处选定接种处，在接种处以斜向下30～35°的角度钻孔，得菌液接种孔；

6、s3接种：将菌液接种至菌液接种孔，封住孔口，观察菌液接种孔的侵染长度、木质部颜色和气味，筛选目标真菌。

7、进一步的，所述促生液体培养基包括：马铃薯浸膏25～30g/l、蛋白胨5～10g/l、葡萄糖18～22g/l、磷酸二氢钾1.8～2.2g/l和谷氨酰胺0.3～0.4mg/l。

8、进一步的，所述振荡培养的频率为140～180r/min，振荡培养的时间为2～7d，振荡培养的温度为27～29℃。

9、进一步的，所述菌液还包括接种至含白木香愈伤组织的液体培养基中，培养，过滤，得增强菌液。

10、进一步的，所述白木香愈伤组织为：通过白木香无菌苗根部诱导得到的白木香愈伤组织，白木香愈伤组织在液体培养基中的添加量为10～15mg/l。

11、更进一步的，所述培养为：边减少培养基体积边进行振荡培养，减少培养基体积的方法包括：每培养20～26h后，倒出培养基总体积的5～8％，共倒出1～3次。

12、更进一步的，所述振荡培养频率为80～100r/min，振荡培养时间为2～3d，振荡培养温度为27～29℃。

13、进一步的，所述菌液接种孔的直径为4.8～5.2mm，深度为5-6cm。

14、更进一步的，所述菌液接种孔间隔至少20cm。

15、进一步的，白木香树干选用至少3年树龄的白木香。

16、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

17、本发明通过培养真菌菌液，对白木香树干的处理，采用菌液接种至菌液接种孔的技术方法，在使白木香树伤害轻微的情况下，可达到在短期内从大量真菌菌株中快速筛选出可诱导结香菌株的效果，结合接种孔的侵染长度、木质部颜色和气味，并可筛选得到诱导结香能力强的结香菌株。

18、本发明提供的快速筛选可诱导白木香结香真菌的方法，该方法操作简便、装置简单，可在几分钟内迅速完成一株菌株的诱导，并且可节约用于试验的白木香树的数量，操作不受天气、温度、风力等因素的干扰，有效且便捷。

19、此外，本发明还通过采用添加白木香愈伤组织的液体培养基，结合培养过程减少培养基体积的方法，可增强待筛选真菌的菌液活力，通过测定增强菌液的吸光度值的方法，可用于初步简单地筛查可诱导白木香结香的真菌，达到更快速地筛选诱导结香能力较强的白木香内生真菌。

技术特征：

1.一种快速筛选可诱导白木香结香真菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的快速筛选可诱导白木香结香真菌的方法，其特征在于，所述促生液体培养基包括：马铃薯浸膏25～30g/l、蛋白胨5～10g/l、葡萄糖18～22g/l、磷酸二氢钾1.8～2.2g/l和谷氨酰胺0.3～0.4mg/l。

3.根据权利要求1所述的快速筛选可诱导白木香结香真菌的方法，其特征在于，所述振荡培养的频率为140～180r/min，振荡培养的时间为2～6d，振荡培养的温度为27～29℃。

4.根据权利要求1所述的快速筛选可诱导白木香结香真菌的方法，其特征在于，所述菌液还包括接种至含白木香愈伤组织的液体培养基中，培养，过滤，得增强菌液。

5.根据权利要求4所述的快速筛选可诱导白木香结香真菌的方法，其特征在于，所述白木香愈伤组织为：通过白木香无菌苗根部诱导得到的白木香愈伤组织，白木香愈伤组织在液体培养基中的添加量为10～15mg/l。

6.根据权利要求4所述的快速筛选可诱导白木香结香真菌的方法，其特征在于，所述培养为：边减少培养基体积边进行振荡培养，减少培养基体积的方法包括：每培养20～26h后，倒出培养基总体积的5～8％，共倒出1～3次。

7.根据权利要求6所述的快速筛选可诱导白木香结香真菌的方法，其特征在于，所述振荡培养频率为80～100r/min，振荡培养时间为2～3d，振荡培养温度为27～29℃。

8.根据权利要求1所述的快速筛选可诱导白木香结香真菌的方法，其特征在于，所述菌液接种孔的直径为4.8～5.2mm，深度为5-6cm。

9.根据权利要求8所述的快速筛选可诱导白木香结香真菌的方法，其特征在于，所述菌液接种孔间隔至少20cm。

10.根据权利要求1所述的快速筛选可诱导白木香结香真菌的方法，其特征在于，白木香树干选用至少3年树龄的白木香。

技术总结
本发明提出了一种快速筛选可诱导白木香结香真菌的方法，包括选取真菌接种至促生液体培养基中，振荡培养，过滤，得菌液；在离地至少20cm处选定接种处，在接种处以斜向下30～35°的角度钻孔，得菌液接种孔；将菌液接种至菌液接种孔，封住孔口，观察菌液接种孔的侵染长度、木质部颜色和气味，筛选目标真菌。本发明通过培养真菌菌液，对白木香树干的处理，采用菌液接种至菌液接种孔的技术方法，在使白木香树伤害轻微的情况下，可达到在短期内从大量真菌菌株中快速筛选出可诱导结香菌株的效果，结合接种孔的侵染长度、木质部颜色和气味，并可筛选得到诱导结香能力强的结香菌株。

技术研发人员：杨云,黄颖,魏建和,李浩凌,陈德力,陈旭玉,李思鹏
受保护的技术使用者：中国医学科学院药用植物研究所海南分所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14