一种牛血中血红素的固相提取方法与流程

本发明涉及血红素制备，尤其是涉及一种牛血中血红素的固相提取方法。

背景技术：

1、血红素是一类天然叶琳化合物，以与有机分子结合的状态广泛存在于动物的血液、肌肉和某些植物组织中。血红素具备重要的生理功能，广泛应用于医疗领域，重点应用于贫血、血液病和肝脏疾病等的诊断和治疗上。

2、血红素在牛血中主要以血红蛋白的形式存在。目前牛血中血红素的提取方法有冰醋酸法、酶解法、酸性丙酮法，这三种提取方法不是操作繁琐就是对环境污染大，另有大量研究表明，这三种提取方法所制备的血红素成品中血红素的纯度并不算高。

3、针对上述中的相关技术，发明人认为牛血中血红素的提取方法还具备改进空间。

技术实现思路

1、为了进一步改善牛血中血红素的提取方法，本技术提供一种牛血中血红素的固相提取方法。因为螯合树脂具备良好的金属离子结合力，因此螯合树脂在无机、冶金、分析、放射化学、制药、催化和海洋化学领域发展迅速，本技术将螯合树脂应用于牛血中血红素的提取上，发现螯合树脂相较于冰醋酸法、酶解法、酸性丙酮法，所提取的血红素纯度并不具备优势。本技术在继续的深入研究中发现，选用特定的acd-100氨基羧酸树脂柱对血红素进行固相提取，并配以特殊组成的洗脱剂，所制备的血红素成品的纯度高达95％-98％，且操作简单、污染小，是一种极具开发潜力的血红素提取方法。

2、本技术提供的一种牛血中血红素的固相提取方法采用如下的技术方案：

3、一种牛血中血红素的固相提取方法，包括以下步骤：

4、s1：在新鲜牛血中添加抗凝剂，离心分离、洗涤后得到红细胞；

5、s2：在红细胞中添加相对于红细胞体积三倍的纯净水将红细胞溶胀破壁、过滤后用3～6m盐酸将过滤溶液的ph值调节至2～3，得备用液；

6、s3：将备用液上样acd-100氨基羧酸树脂柱，待血红素完全吸附在acd-100氨基羧酸树脂上后，用纯水冲洗柱子至无蛋白液流出，再往柱中继续加入洗脱剂，洗脱柱中吸附的血红素，得洗脱液；

7、s4：用3～6m盐酸将洗脱液的ph值调节至4～4.5，析出血红素后将洗脱溶液离心、洗涤、喷雾干燥，得血红素成品；

8、其中，s4的洗脱剂是0.1m氢氧化钠溶液、0.1m碳酸氢三钠溶液、3-乙基-2-甲基-3-戊醇、二乙二醇的复配。

9、上述技术方案中所制备的血红素成品呈钢蓝色粉末状固体，本技术通过acd-100氨基羧酸树脂柱对于血红素的特定强吸附作用，具备良好的分离血红素和珠蛋白的能力，能够从备用液中分离出更多的血红素，通过0.1m氢氧化钠溶液、0.1m碳酸氢三钠溶液、3-乙基-2-甲基-3-戊醇、二乙二醇复配而成的洗脱剂，能够精确地减弱acd-100氨基羧酸树脂和血红素的结合力，精准洗脱血红素，减少acd-100氨基羧酸树脂上杂质的洗脱，使得洗脱液中含有更多的血红素且含有更少的杂质，使得最终制备的血红素具备良好的纯度。

10、优选的，所述acd-100氨基羧酸树脂柱的预处理包括如下步骤：

11、步骤1：将acd-100氨基羧酸树脂装柱；

12、步骤2：用4wt％盐酸溶液以1～2bv/h的流速正向过柱处理2～3bv，再用去离子水正向过柱清洗树脂，至流出液体ph值在6～7，清洗完成后，在acd-100氨基羧酸树脂床层上保留1～2cm的液面高度；

13、步骤3：用4％～6％的氢氧化钠溶液以1～2bv/h的流速正向过柱处理2～3bv，再用去离子水正向过柱清洗树脂，至出口ph在7～9即完成acd-100氨基羧酸树脂柱的预处理。

14、上述技术方案中，通过上述方案预处理而成的acd-100氨基羧酸树脂柱能够充分溶胀，具备更大的比表面积，能够更好地吸附血红素。

15、优选的，所述0.1m氢氧化钠溶液、0.1m碳酸氢三钠溶液、3-乙基-2-甲基-3-戊醇、二乙二醇的质量比是(90～95)：(2～5)：(1～5)：(2～5)。

16、上述技术方案中，通过按照上述质量比配比0.1m氢氧化钠溶液、0.1m碳酸氢三钠溶液、3-乙基-2-甲基-3-戊醇、二乙二醇，具备更好的减弱acd-100氨基羧酸树脂和血红素的结合力的技术效果，更容易将血红素从acd-100氨基羧酸树脂上洗脱下来。

17、优选的，所述0.1m氢氧化钠溶液、0.1m碳酸氢三钠溶液、3-乙基-2-甲基-3-戊醇、二乙二醇的质量比是(90～95)：(2～3)：(1～2)：(2～5)。

18、上述技术方案中，(90～95)：(2～3)：(1～2)：(2～5)的质量比是0.1m氢氧化钠溶液、0.1m碳酸氢三钠溶液、3-乙基-2-甲基-3-戊醇、二乙二醇的最佳质量配比，在此范围内配制而成的洗脱剂对血红素的洗脱效果最好。

19、优选的，所述步骤s3中至少用纯水以1～2bv/h的流速正向过柱处理4～5bv。

20、上述技术方案中，通过限制纯水用量为4～5bv，能够最大程度地洗脱acd-100氨基羧酸树脂柱上的蛋白质并避免血红素的流失，进一步提高血红素的提取纯度。

21、优选的，所述步骤s4中用6m盐酸、6m乙酸的复配溶液将洗脱液的ph值调节至4～4.5，所述6m盐酸、6m乙酸的质量比为(90～95)：(5～10)。

22、上述技术方案中，通过特定选择质量比为(90～95)：(5～10)的6m盐酸、6m乙酸作为血红素析出剂，能够维持洗脱液稳定的ph值，更好更多的析出血红素，并减少析出血红素中的杂质。

23、优选的，所述步骤s4中ph值调节至4.2。

24、上述技术方案中，利用质量比为(90～95)：(5～10)的6m盐酸、6m乙酸将洗脱液ph值调节成特定的4.2，能够最大化地析出洗脱液中的血红素，最大化的减少析出血红素中的杂质，使得提取出的血红素纯度更高。

25、优选的，所述步骤1之后、步骤2之前还包括如下步骤：用95％(v/v)乙醇溶液以1～2bv/h的流速正向过柱处理2～3bv，在acd-100氨基羧酸树脂床层上保留1～2cm的液面高度。

26、上述技术方案中，通过预先用乙醇溶液浸润acd-100氨基羧酸树脂柱，能够更好的溶胀acd-100氨基羧酸树脂，并保证acd-100氨基羧酸树脂具备良好的分散性，后续能够更好的从acd-100氨基羧酸树脂柱中冲洗出蛋白质。

27、综上所述，本技术包括以下至少一种有益技术效果：

28、1.本技术所制备的血红素成品呈钢蓝色粉末状固体，本技术通过acd-100氨基羧酸树脂柱对于血红素的特定强吸附作用，具备良好的分离血红素和珠蛋白的能力，能够从备用液中分离出更多的血红素，通过0.1m氢氧化钠溶液、0.1m碳酸氢三钠溶液、3-乙基-2-甲基-3-戊醇、二乙二醇复配而成的洗脱剂，能够精确地减弱acd-100氨基羧酸树脂和血红素的结合力，精准洗脱血红素，减少acd-100氨基羧酸树脂上杂质的洗脱，使得洗脱液中含有更多的血红素且含有更少的杂质，使得最终制备的血红素具备良好的纯度。

29、2.本技术通过(90～95)：(2～3)：(1～2)：(2～5)的质量比配比0.1m氢氧化钠溶液、0.1m碳酸氢三钠溶液、3-乙基-2-甲基-3-戊醇、二乙二醇，使得所制备的洗脱液具备更好的减弱acd-100氨基羧酸树脂和血红素的结合力的技术效果，更容易将血红素从acd-100氨基羧酸树脂上洗脱下来。

30、3.本技术通过质量比为(90～95)：(5～10)的6m盐酸、6m乙酸将洗脱液ph值调节成特定的4.2，能够最大化的析出洗脱液中的血红素，最大化的减少析出血红素中的杂质，使得提取出的血红素纯度更高。