本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种过表达突变tdp-35的nsc-34细胞模型的构建方法。
背景技术：
1、肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,als)，是选择性地损害运动神经元的慢性进行性变性疾病。其中5～10％的als是家族性als,90％als是散发性als。大约20％的家族性als和3％的散发性als与超氧化物歧化酶1(sod1)基因突变有关。最近，在als患者的运动神经元和胶质细胞的胞核和胞浆中均发现了异常泛素化的蛋白聚集体，主要成分是43kda的tar dna结合蛋白(tdp-43)。并且，tdp-43及其形成的片段tdp-35在als的病理过程中发挥重要作用，但具体机制尚不清楚。自噬(autophagy)是高度保守的细胞生物学行为，其分子机制从酵母细胞到哺乳动物细胞十分相似。在自噬过程中，待降解的胞浆组分及细胞器被包裹在具有双层膜结构自噬小体中，最终与溶酶体融合形成自噬溶酶体，实现胞内物质的降解，从而维持细胞自稳。在中枢神经系统，自噬已成为了清除错误折叠蛋白的重要途径，并对神经元正常功能的维持很必要。在一些神经变性疾病中,其病理机制与细胞内蛋白的异常聚积并形成聚集体和包涵体有关，最近发现alfy与某些泛素化蛋白聚集体的自噬降解有关。alfy(autophagy-linked fyve protein)是一个400kd的蛋白，在哺乳动物组织中普遍存在，脑中含量最多。在正常情况下主要分布于核和核膜，在应激状态，可被募集到胞浆泛素阳性蛋白聚集体。已有研究表明alfy对pd和hd病相关的胞浆聚集蛋白的自噬降解是必需的。在hd神经元模型中过表达alfy能促进polyq聚集体的清除。本课题目的是研究在过表达tdp-35的nsc-34细胞中，alfy能否促进聚集蛋白的清除，并进一步探讨其降解聚集蛋白的机制；明确alfy对突变tdp-43的片段tdp-35的降解机制会为我们最终在临床治疗中调控als相关毒性蛋白质的降解、治疗als疾病提供有用的基础科研数据。
2、als是以运动神经元渐进性变性为主的慢性进展性的神经变性疾病，最终导致瘫痪和死亡。目前学术界认为突变tdp-43是除sod1以外的一种als致病蛋白质。编码tdp-43蛋白质的tardbp基因突变与大约3％的sod1家族性病例和1.5％散发性病例有关，这是继1993年sod1突变致病性的又一大重大发现。tdp-43的片段tdp-35在als发病中作用机制及其降解机制成为了近期神经变性病领域的关注热点。有研究表明：促进相关蛋白质可以减轻神经变性病的毒性蛋白质聚集，延缓变性疾病的进程。目前国内外尚没有对alfy能否促进als相关聚集蛋白的清除及其降解机制的研究报道。明确alfy对突变tdp-43的片段tdp-35的降解机制、判断促蛋白降解能否对运动神经元生存状态带来益处是als研究领域亟待解决的问题，可为今后als的临床治疗的相关研究提供重要参考数据。
技术实现思路
1、针对上述的技术问题，本发明提供了一种过表达突变tdp-35的nsc-34细胞模型的构建方法。
2、为了达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现的：
3、一种过表达突变tdp-35的nsc-34细胞模型的构建方法，包括以下步骤：
4、s1：构建过表达突变tdp-35基因的质粒；
5、s2：将步骤s1所得的过表达突变tdp-35基因的质粒转染至nsc-34细胞中；
6、s3：筛选过表达突变tdp-35的nsc-34细胞；
7、s4：对过表达突变tdp-35的nsc-34细胞进行功能研究。
8、进一步的，所述步骤s1包括以下子步骤：
9、s1.1：设计质粒，通过bioinformatic软件设计合成过表达突变tdp-35基因的质粒；
10、s1.2：pcr扩增tdp-35基因的dna序列，从tdp-35基因的dna序列中设计引物进行pcr扩增，将tdp-35基因克隆到表达载体上进行后续实验；
11、s1.3：克隆到表达载体上，将pcr扩增产品与表达载体酶切后进行连接，将tdp-35基因克隆到表达载体上；
12、s1.4：突变质粒，通过定向突变或点突变技术对克隆后的表达载体进行突变操作；
13、s1.5：质粒鉴定和测序，通过限制性酶切和测序的实验手段，对构建后的质粒进行鉴定和测序，确保质粒构建的正确性；确定用于转染细胞的正确可行的质粒。
14、进一步的，所述步骤s1.2中pcr反应具体包括：模板dna数量：100ng；引物浓度：0.2μm；taq；酶浓度：0.06u/μl；dntp浓度：0.2mm；pcr反应体系总体积为50μl；pcr反应条件为94℃预变性5min，96℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，72℃延伸5min，4℃保存。
15、进一步的，所述步骤s1.3中酶切反应具体包括：模板dna数量：1μg；酶切缓冲液2μl、酶2μl、模板dna10μg、水至总体积20μl；酶切温度和切位及时间根据实验室酶切的习惯和酶切位点的不同而有所不同，具体温度和时间需按照酶的厂商说明进行设置。
16、进一步的，所述步骤s1.4中定向突变具体包括：将合成的dop-pcr产品与克隆好的表达载体进行配对突变；点突变：通过site-directed mutagenesis kit工具进行点突变。
17、进一步的，所述步骤s2包括以下子步骤：
18、s2.1：细胞培养，在96孔板中培养nsc-34细胞，需要接种2万个细胞至每个孔中，每个孔需添加200μl培养液；在37℃、5％co2的环境下培养；
19、s2.2：转染实验，转染方法可以选择瞬时转染、磷酸钙法、脂质体法、电穿孔法、基因枪法；其中瞬时转染的具体操作步骤包括：在细胞培养皿中预先培养nsc-34细胞系至70％到80％的密度，以便在转染时细胞生长状态良好；将合适的表达载体和转染试剂混合，生成转染复合物，转染试剂为lipofectamine 2000、polyjet、pei其中一种；将转染复合物均匀地加到培养皿中的细胞中，使其与细胞膜结合并进入细胞质中；将细胞培养皿放置在37℃、5％co2的细胞培养箱中，让细胞在适宜的环境中进行转染和表达；在转染后36小时收集转染细胞进行后续的检测；
20、磷酸钙法：将500ng的质粒和转染试剂混合，使其在室温下反应，再通过添加到nsc-34细胞中使其转染至细胞中；反应时间5～20min，一般用20～30μl的转染混合物处理96孔板的每个孔；
21、s2.3：初始培养过程，转染后，培养24～48小时，以使细胞充分表达突变tdp-35。
22、进一步的，所述步骤s3包括以下子步骤：
23、s3.1：荧光显微镜观察，通过将荧光基因与过表达突变tdp-35基因联合表达，转染到nsc-34细胞中，然后使用荧光显微镜检测，筛选出表达荧光的细胞；荧光显微镜的参数：显微镜荧光灯光强度：20～40％，线性增益：50～100倍，感光器件设置：曝光时间设置为100～500ms。
24、s3.2：westernblot法检测，使用westernblot法检测细胞是否表达过表达突变tdp-35蛋白；westernblot法操作步骤：细胞收集后，加入蛋白质提取液混合制备蛋白提取物，蛋白质提取物电泳至sds-page胶中，将蛋白质转移到pvdf膜上，再使用tdp-35特异性抗体检测。
25、进一步的，所述步骤s4包括以下子步骤：
26、s4.1：细胞生长分析，可以通过cck8法或mtt法，分析细胞生长的变化；cck8法：将cck8液在无菌条件下加入到培养液中，处理后1～3小时，可以将95％的转换率转化为颜色反应；
27、s4.2：分化分析，可以通过分析分化相关蛋白的表达，通过nf-200、gap-43、tuj1蛋白的表达，来分析nsc-34细胞是否分化；westernblot法操作步骤与步骤s3.2一致；
28、s4.3：凋亡分析，可以通过annexinv/pi双染法或tunel法分析细胞凋亡的变化；annexinv/pi双染法：将annexinv/fitc和pi混合，加入到每个形态上出现异常的细胞样本中，然后在黑暗的条件下孵育30min；对于未处理的细胞样品进行荧光显微镜检测，根据细胞的荧光颜色判断细胞的生死状态。
29、s4.4：代谢分析，可以通过测量lactate dehydrogenase(ldh)含量来分析细胞代谢的变化；ldh方法：采用ldh检测试剂盒检测，按照说明书操作；
30、s4.5：信号传导分析，可以通过western blot法来分析信号传导通路的变化。
31、另一方面，本发明提出上述的构建方法于筛选预防或治疗肌萎缩侧索硬化症药物中的应用。
32、另一方面，本发明提出上述的构建方法于制备预防或治疗肌萎缩侧索硬化症药物中的应用。
33、有益效果
34、本发明提出的一种过表达突变tdp-35的nsc-34细胞模型的构建方法，创建过表达突变tdp-35的nsc-34细胞模型：本实验采用瞬时转染的方法在nsc-34细胞系中过表达tdp-43的c末端毒性片段tdp-35，用western blotting方法鉴定突变蛋白质是否过表达，以此模拟病人运动神经元中突变tdp-35包涵体病理。
35、本发明主要研究对象是肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,als)，这是一种神经退行性疾病。通过过表达tdp-35的c末端毒性片段，可以模拟突变tdp-43包涵体的形成过程，进一步研究tdp-43在als中的作用机制，为未来研究als的分子机制提供更多的信息。此外，通过研究明确alfy对突变tdp-43的片段tdp-35的降解机制，可以为als的治疗提供重要参考数据。
36、这个技术方案的有益效果主要包括：
37、模拟疾病过程：tdp-43是一个重要的rna结合蛋白，在多种神经退行性疾病中起到了重要作用。深入研究tdp-43在als中的作用机制：突变tdp-43与包涵体形成的蛋白聚集是神经退行性疾病的主要病理特征之一。通过模拟突变tdp-43包涵体的形成过程，可以深入研究tdp-43在als中的作用机制，从而发现相关的分子途径、靶点和治疗方法，这将有助于寻找更有效的治疗策略；进一步研究突变tdp-35包涵体病理特征，为未来研究疾病治疗提供更多的信息。
38、研究alfy与自噬通路的关系：alfy是自噬通路的一个关键组成部分，可以促进突变蛋白的降解和清除，从而减少由于突变蛋白的积累而引起的细胞毒性。通过研究明确alfy与自噬通路的关系，可以深入研究自噬通路在als中的作用机制，从而为als的治疗提供新的思路和方法。
39、建立更全面的als动物模型：目前，临床治疗als的药物治疗效果较差，主要原因在于缺乏具有高度可靠性和复杂性的als动物模型。通过过表达tdp-35的c末端毒性片段，可以建立更全面的als动物模型，包括细胞和动物模型，从而为als的研究和临床治疗提供重要的参考和基础。
40、判断促蛋白降解的益处：通过判断促蛋白降解能否对运动神经元生存状态带来益处，可以为als的临床治疗提供重要参考数据，为发现治疗als的新方法和策略提供基础。
41、高通量：westernblotting是一种常用的蛋白质检测方法，具有高通量、高灵敏度和高特异性等优势，可以对大量样品进行快速分析。通过使用westernblotting检测突变蛋白质是否过表达，可以快速准确地验证细胞是否过表达tdp-35的c末端毒性片段，从而建立高通量的实验平台，为研究突变tdp-35包涵体病理特征提供可靠的基础。
42、瞬时转染是一种常用的基因转染方法，其优点包括无需构建稳定转染细胞系、转染效率高、转染后效果明显等。在nsc-34细胞系中过表达tdp-35的c末端毒性片段，可以快速、有效、可靠地创建过表达突变tdp-35的nsc-34细胞模型。
43、tdp-43突变已被证实与多种神经退行性疾病相关，如肌萎缩性侧索硬化症、前体肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默病等。研究突变tdp-35包涵体的病理特征可以为疾病的分子机制研究提供新的论据，同时可为疾病的治疗提供更多选择。这一技术方案为相关疾病的研究和治疗奠定了坚实的基础。
44、总之，本发明技术方案为als的研究和治疗提供了重要的参考价值，对改善als患者的生活质量具有重要意义。深入研究tdp-43在als中的作用机制、建立更全面的als动物模型、研究alfy与自噬通路的关系，从而为als的研究和临床治疗提供重要的参考和基础。
45、当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。