检测猫支原体的环介导等温扩增引物组及试剂盒的制作方法

本发明涉及生物检测，具体涉及检测猫支原体的环介导等温扩增引物组及试剂盒。

背景技术：

1、猫支原体(mycoplasma feline)属于一种微小的、没有细胞壁的原核生物，能通过细菌滤器，是介于病毒和细菌之间独立生存的微生物，革兰染色为阴性。猫的支原体主要感染猫的眼部和上呼吸道，可在猫之间传播，造成患猫结膜严重水肿和轻度鼻炎。据统计35％的健康猫的咽喉中也能分离到支原体，所以支原体也可能是一种条件性致病菌，继发于其它病因引起的炎症。早期快速诊断感染能够及时指导临床治疗，为合理选择抗细菌药物提供依据并在防止抗生素滥用方面具有重要意义。

2、当前已建立了多种猫支原体检测方法，主要包括采用传统培养基法(病原微生物分离鉴定、形态学鉴定及自动化鉴定方法)、酶联免疫技术、核酸探针技术、核酸扩增(pcr)技术等，但都存在不足，如电镜方法复杂昂贵，细菌分离培养耗时极长且假阳性较多，在拿到培养结果后通常已失去临床意义。pcr检测法近年来在临床检测中应用颇多，如常规pcr、实时荧光定量pcr等，在病原微生物的检测以及疾病诊断方面作用重大，但其一般需要能够进行精密控温的仪器来进行高级复杂的分析，并且对检测人员的操作要求较高，反应时间较长，不适用于样品的现场检测，不利于基层推广，无法满足疾病防控简单、快速、准确的检测要求。

3、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,lamp)通过识别靶序列上6个特异区域的引物，在一种具有链置换特性的dna聚合酶——bst酶(bst dnapolymerase)的作用下，能够在恒温条件下高效、快速、特异地扩增dna靶序列。在lamp体系中加入荧光染料，可根据反应体系中的荧光信号强度来判断反应的进行情况。目前，lamp技术已经被广泛应用于病原微生物的检测中，包括人类致病微生物、动植物病毒以及寄生虫所致疾病的诊断。因此利用环介导等温扩增技术来检测猫支原体对于动物医学的临床诊断具有重要的意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供检测猫支原体的环介导等温扩增引物组及试剂盒，本发明提供的三对特异性环介导等温扩增引物主要用于检测各种标本中的猫支原体，包括外引物、内引物和环引物，能够缩短检测时间。

2、本发明提供了以seq id no：1所示的核酸序列为标志物，在制备检测猫支原体(mycoplasma feline)的环介导等温扩增引物中的应用。

3、本发明通过试验发现，相对于其他片段，seq id no：1所示的核酸序列作为标志物时，检测效果更好，特异性和灵敏度高于其他核酸序列。基于此，对seq id no：1所示的核酸序列进行特异性分析发现，该核酸序列保守性更强(如图1所示)，能够特异性检测猫支原体。

4、本发明提供了检测猫支原体(mycoplasma feline)的环介导等温扩增引物组，其包括一对外引物f3和b3、一对内引物fip和bip和一对环引物lf和lb；

5、所述外引物对中两条引物的核酸序列分别如seq id no：2或3所示；

6、所述内引物对中两条引物的核酸序列分别如seq id no：4或5所示；

7、所述环引物对中两条引物的核酸序列分别如seq id no：6或7所示。

8、本发明通过设计多组引物来筛选检测效果最好的引物组，结果表明利用本发明所述的三对引物检测样本中的猫支原体时，效果比其他引物组好，反应进程能够加快，反应时间能够缩短。

9、具体的，在本发明的实施例中，本发明提供的三对引物能检测出来不同浓度梯度的猫支原体质粒dna，在30min内的最低检出限为1个拷贝的目标核酸，说明本发明所述的引物组具有较高的灵敏度；检测含有其他病毒或支原体的样本时，荧光值趋近于零，说明本发明所述的引物组具有较高的特异性；且本发明所述引物组的检测结果不受样本种类的干扰，具有较高的准确性。

10、本发明提供了所述的引物组在制备检测猫支原体的试剂或试剂盒中的应用。

11、本发明还提供了检测猫支原体的试剂或试剂盒，包括本发明所述的引物组。

12、进一步的，所述试剂盒中的引物f3、b3、fip、bip、lf和lb的摩尔比为(0.1～1)：(0.1～5)：(0.1～5)：(0.1～5)：(0.1～3)：(0.1～3)。

13、更进一步的，所述试剂盒中的引物f3、b3、fip、bip、lf和lb的摩尔比为(0.3～0.5)：(1～2)：(2.4～3.4)：(2.4～3.4)：(1～2)：(1～2)。

14、本发明所述的试剂或试剂盒中还包括缓冲液、dna聚合酶和荧光染料eva-green。

15、优选的，所述缓冲液的浓度为1x，dna聚合酶的浓度为0.1～0.5u/μl，荧光染料eva-green的浓度为0.4～1μm。

16、具体的，在本发明的实施例中，所述的试剂或试剂盒包括0.3μmol/l f3、2μmol/lb3、2.4μmol/lfip、2.4μmol/l bip、1μmol/l lf、1μmol/l lb、1x缓冲液、0.2u/μldna聚合酶、0.6μm荧光染料eva-green。

17、所述的试剂或试剂盒在检测猫支原体时的反应条件为60～65℃。

18、本发明还提供了检测猫支原体的方法，其包括利用本发明所述的试剂盒对样本进行检测。

19、本发明提供了提供检测猫支原体的环介导等温扩增引物组及试剂盒，能够在30分钟内检测出1个拷贝的病毒核酸，极大地加速了反应进程，缩短了反应时间；本发明在三对特异性引物的基础上建立的猫支原体检测方法具有准确性高、灵敏度高、特异性强的特点。

20、本发明提供的猫支原体检测方法中加入了荧光染料eva-green，该染料在反应配置时加入，反应过程中能够通过采集的荧光值变化来检测反应情况，无需开盖，极大地降低了污染的可能性，减少了假阳性的发生。

技术特征：

1.以seq id no：1所示的核酸序列为标志物，在制备检测猫支原体(mycoplasmafeline)的环介导等温扩增引物中的应用。

2.检测猫支原体(mycoplasma feline)的环介导等温扩增引物组，其特征在于，其包括一对外引物f3和b3、一对内引物fip和bip和一对环引物lf和lb；

3.权利要求2所述的引物组在制备检测猫支原体的试剂或试剂盒中的应用。

4.检测猫支原体的试剂或试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的引物组。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的引物f3、b3、fip、bip、lf和lb的摩尔比为(0.1～1)：(0.1～5)：(0.1～5)：(0.1～5)：(0.1～3)：(0.1～3)。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的引物f3、b3、fip、bip、lf和lb的摩尔比为(0.3～0.5)：(1～2)：(2.4～3.4)：(2.4～3.4)：(1～2)：(1～2)。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其还包括缓冲液、dna聚合酶和荧光染料eva-green。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液的浓度为1x，dna聚合酶的浓度为0.1～0.5u/μl，荧光染料eva-green的浓度为0.4～1μm。

9.根据权利要求4～8所述的试剂盒，其特征在于，其包括0.3μmol/l f3、2μmol/l b3、2.4μmol/l fip、2.4μmol/l bip、1μmol/l lf、1μmol/l lb、1x缓冲液、0.2u/μldna聚合酶、0.6μm荧光染料eva-green。

10.根据权利要求4～9所述的试剂盒，其特征在于，其在检测猫支原体时的反应条件为60～65℃。

技术总结
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及检测猫支原体的环介导等温扩增引物及试剂盒。本发明提供的引物组包括外引物对、内引物对和环引物对能够特异性检测猫支原体。利用该引物组建立的检测猫支原体的LAMP检测方法准确性高，灵敏度高，特异性强，且不会受到样本种类的干扰。

技术研发人员：文飞,李玉翠
受保护的技术使用者：北京泰豪生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16