一个新型报告基因hbpR的鉴定及其应用

【】本发明涉及报告基因，特别涉及可视化红色蛋白编码基因hbpr的报告系统构建及其应用。

背景技术

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背景技术：

1、报告基因分析是生物医学和药学研究的一个非常有价值的工具，用于监测与基因表达、调节和信号转导相关的细胞事件。基于通过将反应元件连接到这些报告基因上而介导的报告基因活性的改变，可以提供一种灵敏、可靠和方便的测定法来有效地报告特定信使级联的激活及其对细胞或活体中基因表达和调节的影响。报告基因具有以下特征：(1)序列是已知的；(2)细胞中无类似物；(3)检测快速、简便、灵敏度高；(4)对基因的表达进行动态观察；(5)不影响宿主生理活性等。目前常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶(cat)、碱性磷酸酶(ap)、β-半乳糖苷酶(β-gal)、绿色荧光蛋白(gfp)、荧光素酶等。常见的报告基因系统具有如下特点：①氯霉素乙酰转移酶具有无内源性活性、稳定的优势，但是其依赖于放射化学物质；测定的线性范围和灵敏度不如其他报告基因；②碱性磷酸酶具有多种多样的分析方法、高灵敏性、具有线性范围的优势，但大多数细胞存在内源性活性；③β-半乳糖苷酶具有特征鲜明、稳定、简单的比色读数、提供灵敏的生物或化学发光分析的优势，但是其需要底物onpg/x-gal的存在，片段约3kb，增加载体负担，哺乳动物细胞中存在内源性活性；④绿色荧光蛋白具有自发荧光(不需要底物)、无内源性活动、光谱质量改变的突变体可用的优势，但是其需要翻译后修饰；低灵敏度；会出现荧光淬灭的缺陷；⑤荧光素酶具有灵敏度高；无内源性活动；宽动态范围；分析便捷的优势，但是需要底物(荧光素)以及o2和atp的存在的缺陷。因此，为了提高报告基因的应用范围，不断发现新报告基因，并构建新的报告系统，是目前该领域研究的重点。本发明鉴定了一种新的报告基因hbpr，并成功构建了基于hbpr的报告系统，较于现有报告系统更加便捷高效、成本低廉。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、鉴于上述内容，发明人鉴定了一种更加便捷高效的报告基因，该基因表达的红色蛋白可以直接用肉眼观察，可视化明显；为基因的转录调控研究和启动子筛选提供了更为快速于便捷的技术手段。

2、为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

3、编码可视化红色蛋白的报告基因hbpr，所述报告基因hbpr的核苷酸序列如序列表seq id no:1所示。

4、本发明还包括包含所述报告基因hbpr的报告系统，所述报告系统含重组质粒pet28exba-hbpr，所述重组质粒pet28exba-hbpr的核酸序列如表seq id no:4所示。

5、本发明还包括包含所述报告基因hbpr的报告系统构建方法，所述方法包括如下步骤：

6、(1)以耻垢分枝杆菌为模板，设计引物对hbpr-ecori-f/hbpr-xbai-r扩增出hbpr基因片段，所述hbpr基因核酸序列如序列表seq id no:1所示；所述hbpr-ecori-f的核酸序列如序列表seq id no:2所示；所述hbpr-xbai-r核酸序列如序列表seq id no:3所示；

7、(2)琼脂糖凝胶电泳进行检测，片段大小和浓度符合预期后，回收步骤(1)的片段；

8、(3)用ecori和xbai酶切好的pet28exba载体和步骤(2)回收的片段连接，获得重组质粒pet28exba-hbpr；所述重组质粒pet28exba-hbpr的核酸序列如表seq id no:4所示；

9、(4)对步骤(3)的pet28exba-hbpr重组质粒原有的诱导型启动子t7-lac的两侧设计反向扩增引物对：cm1-hbpr-f-nhei/cm1-hbpr-r-hindiii，以pet28exba-hbpr重组质粒为模板进行反向扩增，回收扩增片段后，用限制性内切酶hindiii和nhei进行酶切得到含报告基因的线性化载体，将其命名为pet28exba-hbpr(hindiii/nhei)；所述cm1-hbpr-f-nhei的核酸序列如序列表seq id no:5所示；所述cm1-hbpr-r-hindiii的核酸序列如序列表seqid no:6所示。

10、本发明还包括所述的报告系统在检测不同启动子启动活性上的应用。

11、进一步的，所述启动子为大肠杆菌表达系统的常用启动子。

12、本发明还包括应用所述报告系统评价不同启动子启动活性的方法，所述方法包括如下步骤：

13、(1)选取不同强度的启动子，设计含有hindiii和nhei酶切位点的引物；

14、(2)退火得到含hindiii和nhei酶切位点的启动子片段，将启动子片段与pet28exba-hbpr(hindiii/nhei)进行连接并转化到大肠杆菌bl21(de3)菌株中，验证成功后得到不同启动子的重组菌株；

15、(3)将重组菌株的菌液等量接种到培养基中，培养相同时间后，通过肉眼判定或通过对红色蛋白进行定量检测的方式，对比判定启动子的强弱。

16、进一步的，所述步骤(1)不同强度的启动子分别为：ptrc、placuv5、pt7、ptrp、ptac、pbad、plac和pl；所述启动子ptrc的引物对如序列表seq id no:7和seq id no:8所示；所述启动子placuv5的引物对如序列表seq id no:9和seq id no:10所示；所述启动子pt7的引物对如序列表seq id no:11和seq id no:12所示；所述启动子ptrp的引物对如序列表

17、seq id no:13和seq id no:14所示；所述启动子ptac的引物对如序列表seq idno:15和

18、seq id no:16所示；所述启动子pbad的引物对如序列表seq id no:17和seq idno:18所示；所述启动子plac的引物对如序列表seq id no:19和seq id no:20所示；所述启动子pl的引物对如序列表seq id no:21和seq id no:22所示。

19、进一步的，所述步骤(3)中肉眼判定的方法为：培养相同时间后，通过肉眼观察不同重组菌株的菌液或菌体颜色；当菌液或菌体的红色越明显说明启动子的启动活性越强；红色越不明显，说明启动子的启动活性越弱。

20、进一步的，所述步骤(3)的定量检测的方法为：培养相同时间后，对菌体进行裂解后测定其上清液的od410(hbpr蛋白的特征吸收峰)吸光度值，数值越高代表红色蛋白质的含量越多，说明启动子的活性越强；吸光度值越低代表红色蛋白含量越少，说明启动子的活性越弱。

21、进一步的，所述对菌体进行裂解的裂解液配制方法为，将5m尿素和10mg/ml溶菌酶按照9:1的体积比配制、混匀即得、现配现用。

22、本发明具有如下有益效果：

23、发明人发现了耻垢分枝杆菌中的一种红色蛋白hbpr。该蛋白可以与血红素结合并使之呈现红色，同时这种红色蛋白可以直接用肉眼观察，可视化明显。发明人成功验证了红色蛋白编码基因hbpr具有报告基因的功能，可通过肉眼观察初步判断该报告基因的表达量，也可以通过紫外分光光度计或酶标仪等方式快速的检测出其具体结果。利用不同强度的启动子对该报告系统进行验证，发现该报告系统可以有效的评估启动子的启动活性。该报告系统保留原有lacz和gfp报告系统的优势，并同时改进了其不足。该报告系统具有报告基因分子量小，操作灵活，便捷高效，成本低等优点，具有广泛的应用前景。