用于细菌检测的层层荧光薄膜检测器及其制备方法和应用

本发明涉及传感器，尤其涉及一种用于细菌检测的层层荧光薄膜检测器及其制备方法和在细菌进行荧光检测中的应用。

背景技术：

1、食品及饮用水中细菌的含量是评估其安全性的重要生化指标，传统方法通过琼脂培养再菌落计数的方式对细菌进行检测，但是存在耗时长(37～48h)、能检测的菌株有限等问题。基于电化学阻抗波谱和表面等离子体共振技术发展的细菌检测法，具有灵敏度高和检测速度快的优点，但是仍存在设备复杂和对操作人员要求高等问题。

2、因此，发展简单快速的荧光检测法具有重要的实际意义。荧光薄膜检测法相对于荧光液相检测法在操作方面更加便捷、作用时间更短及可重复利用等优势。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有细菌检测法所存在的缺陷，提供一种用于细菌检测的层层荧光薄膜检测器及其制备方法和在细菌检测中的应用。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明的第一个方面是提供一种用于细菌检测的层层荧光薄膜检测器的制备方法，以生物相容性单元、荧光基团单元、阴/阳离子单元为共嵌段聚合物单体，采用可逆加成-断裂链转移聚合反应(raft)分别制备带负电荷/正电荷的荧光聚合物；

4、再将带负电荷/正电荷的荧光聚合物分别配制为带正电荷/负电荷的荧光聚合物溶液，基于静电吸附作用，通过层层自组装法(layer-by-layer assembly)在带负电荷的玻璃载体上交替沉积荧光聚阳离子和荧光阴聚离子，即得具有荧光特性的纳米级薄膜检测器。

5、具体地，所述的用于细菌检测的层层荧光薄膜检测器的制备方法，包括如下步骤：

6、(1)将生物相容性单元、荧光基团单元、阴/阳离子单元与链转移剂ttca按比例加入到含二恶烷溶剂的圆底烧瓶中，然后在剧烈搅拌下加入引发剂acpa，混合物在冰浴里除氧25～40min后，于78～82℃下进行聚合反应；

7、(2)通过核磁共振光谱监测聚合反应的进程，待聚合完成之后，将圆底烧瓶放入冰水中，淬灭聚合反应，所得产物进一步通过p聚丙烯酰胺凝胶色谱柱进行纯化，得到带负电荷/正电荷的荧光聚合物；

8、(3)将步骤(2)所得产物分别配制成不同浓度的带正电荷/负电荷的荧光聚合物水溶液，分别加入不同剂量的nacl，调控溶液ph值，得到不同浓度的荧光聚阴/阳离子沉积溶液；

9、(4)将载玻片处理为表面带负电荷的玻璃载体，然后交替浸入荧光聚阴/阳离子沉积溶液中，并用氮气吹尘枪将表面吹干，得到具有荧光特性的纳米级薄膜检测器。

10、优选地，步骤(1)中，所述阴/阳离子单元为丙烯酸(aa)、2-(二甲基氨)乙基丙烯酸酯(dmea)、[2-(丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵(tmea)、3-磺酸丙基甲基丙烯酸酯(spmp)中的一种或几种。需注意的是，通常在制备聚阳离子时，只加阳离子；在制备聚阴离子时，则加阴离子。不可在一种聚合物中同时加入阴离子和阳离子。

11、优选地，步骤(1)中，所述荧光基团单元为bodipy基、罗丹明基、荧光素、荧光量子点中的一种或几种。

12、优选地，步骤(1)中，所述生物相容性单元、荧光基团单元、阴/阳离子单元的摩尔比为3:1:3，带负电荷或正电荷荧光聚合物的聚合度n分别为2，14。

13、较为优选地，步骤(1)中，所述生物相容性单元、荧光基团单元、阴/阳离子单元的摩尔比为3:0.8-2:2-4，带负电荷或正电荷荧光聚合物的聚合度n分别为2，14。

14、优选地，步骤(1)中，所述除氧工艺为向圆底烧瓶中通入氮气、氩气，以去除圆底烧瓶中的氧气。

15、优选地，步骤(3)中，所述正电荷和带负电荷的荧光聚合物溶液的浓度为1.3×10-7～1.3×10-4mol/l。

16、较为优选地，步骤(3)中，所述正电荷和带负电荷的荧光聚合物溶液的浓度为1.3×10-4mol/l，1.3×10-6mol/l，5.0×10-7mol/l，1.3×10-7mol/l。

17、优选地，步骤(3)中，所述nacl的投加量为0.01～0.1mol/l；ph值为3.2～5.5。

18、较为优选地，步骤(3)中，所述nacl的投加量为0.1mol/l，0.05mol/l，0.01mol/l；带正电荷/负电荷的荧光聚合物水溶液的ph值对应为5.5，3.2。

19、优选地，步骤(4)中，所述载玻片为普通商用载玻片、ito载玻片，其采用piranha溶液处理法或等离子体处理法处理为带负电荷的玻璃载体。

20、优选地，步骤(4)中，所述层层自组装法包括但不限于基于静电吸附、氢键、配位键、化学键作用力。

21、优选地，步骤(4)中，所述吹尘枪包括但不限于氮气、压缩空气、氩气。

22、本发明的第二个方面是提供一种如上述所述方法制备的层层荧光聚合物薄膜检测器。

23、本发明的第三个方面是提供一种所述的层层荧光聚合物薄膜检测器在细菌进行荧光检测中的应用。

24、优选地，所述细菌包括食品或饮用水中的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌。

25、优选地，对所述细菌进行荧光检测的方法为：采用层层荧光薄膜检测器，在其薄膜表面滴加细菌悬浮液，培养10min后观察荧光成像。

26、较为优选地，所述细菌为大肠杆菌，在所得的沉积12次荧光聚合物的层层荧光薄膜上滴加od@600nm值0.2的大肠杆菌悬浮液2μl，静置培养10min后，用m9培养液洗涤2次，再滴加2μlm9培养液后盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察。

27、本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

28、(1)本发明创造性地将具有不同功能的单体通过聚合的方式得到荧光聚阴离子和荧光聚阳离子，进一步利用静电吸附作用，采用层层自组装技术制备荧光聚合物薄膜检测器，其在细菌荧光成像方面呈现出优良的染色率；

29、(2)本发明通过调控不同链长和荧光基团，制备不同特性的层层荧光薄膜检测器，可大幅提升对大肠杆菌的富集及荧光染色，实现对大肠杆菌的可视化快速检测，并且成像效果随着荧光薄膜的特性方便可调；

30、(3)相比现有的荧光液相检测法，基于本发明层层荧光薄膜检测器的荧光薄膜检测法，因其具有较好的荧光特性，用于对细菌检测具有操作方便、作用时间短且可循环使用等优势。

技术特征：

1.用于细菌检测的层层荧光薄膜检测器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的用于细菌检测的层层荧光薄膜检测器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述阴/阳离子单元为丙烯酸(aa)、2-(二甲基氨)乙基丙烯酸酯(dmea)、[2-(丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵(tmea)、3-磺酸丙基甲基丙烯酸酯(spmp)中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的用于细菌检测的层层荧光薄膜检测器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述荧光基团单元为bodipy基、罗丹明基、荧光素、荧光量子点中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的用于细菌检测的层层荧光薄膜检测器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述生物相容性单元、荧光基团单元、阴/阳离子单元的摩尔比为3:1:3，带负电荷/正电荷的荧光聚合物的聚合度n分别为2，14。

5.根据权利要求1所述的用于细菌检测的层层荧光薄膜检测器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述正电荷和带负电荷的荧光聚合物溶液的浓度为1.3×10-7～1.3×10-4mol/l。

6.根据权利要求1所述的用于细菌检测的层层荧光薄膜检测器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述nacl的投加量为0.01～0.1mol/l；ph值为3.2～5.5。

7.根据权利要求1所述的用于细菌检测的层层荧光薄膜检测器的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述载玻片为普通商用载玻片、ito载玻片，其采用piranha溶液处理法或等离子体处理法处理为带负电荷的玻璃载体。

8.采用如权利要求1至7任一项所述方法制备的层层荧光聚合物薄膜检测器。

9.如权利要求8所述的层层荧光聚合物薄膜检测器在细菌进行荧光检测中的应用。

10.根据权利要求9所述的层层荧光聚合物薄膜检测器在细菌进行荧光检测中的应用，其特征在于，所述细菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌。

技术总结
本发明属于传感器技术领域，公开了一种用于细菌检测的层层荧光薄膜检测器及其制备方法和在细菌检测中的应用。该制备方法是以生物相容性单元、荧光基团单元、阴/阳离子单元为共嵌段聚合物单体，采用可逆加成‑断裂链转移聚合反应制备分别带负/正电荷的荧光聚合物；再分别配制带正电荷和带负电荷的荧光聚合物溶液，并通过层层自组装法交替在带负电荷的玻璃载体上沉积荧光聚阴/阳聚离子，即得。本发明将具有不同功能的单体通过聚合的方式得到荧光聚阴/阳离子，然后采用层层自组装技术制备荧光聚合物薄膜，通过调控不同链长和荧光基团，提升对大肠杆菌的富集及荧光染色，实现对大肠杆菌的可视化快速检测，且其测法方法操作方便、可循环使用。

技术研发人员：田亚洋,王晨阳,陈林枫,王小波
受保护的技术使用者：湖北科技学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14