一种眼科常见病毒的多重PCR检测的引物探针组、检测方法及试剂盒与流程

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种眼科常见病毒的多重pcr检测的引物探针组、检测方法及试剂盒。

背景技术：

1、感染性眼病是全球最常见的眼部疾病，包括结膜炎、睑缘炎、泪囊炎等非致盲性眼病和角膜炎、葡萄膜炎、眼内炎等致盲性眼病。因感染原因和部位的不同，其临床表现和预后也不一。轻微的眼部感染仅引起眼部不适症状，如眼红、眼痒和异物感等，而严重感染会引起角膜溃疡、化脓、穿孔以及眼内炎等，从而影响患者视力，严重者甚至有失明和眼球摘除的风险。因此，对眼部感染性疾病进行规范化诊治尤为重要。

2、迄今为止，较常见的眼部感染性病毒主要有：腺病毒(adv)、人巨细胞病毒(cmv)、单纯疱疹病毒i型(hsvi)、水痘-带状疱疹病毒(vzv)；临床少见的有单纯疱疹病毒ⅱ型(hsvⅱ)。表象一致的炎症均可由不同的病毒感染所致，且不同的病毒对药物的敏感性有所不同，如hsvi，hsvⅱ和vzv对阿昔洛韦和伐昔洛韦敏感，cmv对更昔洛韦比较敏感。因此，临床上迫切需要一种感染性眼病病原体检测，并依据病原学对眼部疾病采取针对性的治疗手段。

3、临床上需要临床医师和检验医师运用各种检查方法和检测技术对眼部感染性疾病进行快速的病原学诊断，同时结合特征性的临床体征，才能实现对疾病的精准治疗。常规眼部感染性疾病的诊治，依赖于细菌培养、真菌检测等诊断方式，对于病毒感染还需要细胞学、病原学检查。尽管微生物培养和鉴定是眼部感染性疾病诊断的金标准，但仍受到微生物生长缓慢和生存能力较低的限制，且采样前的抗微生物药物使用会产生假阴性结果，特别是混合感染的鉴定，传统培养鉴定受到更多限制。分子生物学技术的快速发展，使得感染性疾病通过分子生物学技术鉴定病原成为可能，并日趋成熟。

4、目前已有研究表明使用普通pcr或实时荧光定量pcr可实验对眼部组织中病毒dna的检测。但是基于普通pcr技术建立的实验室检测技术往往存在一些不足：1)普通pcr需要通过凝胶电泳实验做定性检测，耗时至少4小时以上；2)一个反应管只能检测一种病毒，需要检测多个病毒时需要多个反应管的检测，而眼科标本量少，通常2-50ul，无法满足多个病毒的检测量。实时荧光定量pcr是普通pcr上建立起来的快速、简便的核酸扩增技术。在pcr反应体系中加入荧光基团，使用实时荧光pcr仪实时检测荧光信号积累与扩增循环数之间的关系，来判断是否存在待测目标物。目前基于实时荧光pcr方法建立的检测技术大多数是一个反应管检测1种～3种病毒，并且样本需要进行简单前处理(离心等)或者进行核酸提取，而临床眼科病变样本量本来就很少，所以难以适应临床需要。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种眼科常见病毒的多重pcr检测方法，该方法可以解决现有检测技术中存在的样本处理繁琐、样本需求量大、pcr检测时间偏长、检测病原体单一等缺点。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一种眼科常见病毒的多重pcr检测的引物探针组，所述引物探针组包括

4、用于检测腺病毒的引物，如seq id no.1～2所示的核苷酸序列，taqman探针如seqid no.3～4所示的核苷酸序列；

5、用于检测人巨细胞病毒的引物，如seq id no.5～6所示的核苷酸序列，taqman探针如seq id no.7所示的核苷酸序列；

6、用于检测单纯疱疹病毒ⅰ型的引物，如seq id no.8～9所示的核苷酸序列，taqman探针如seq id no.10所示的核苷酸序列；

7、用于检测单纯疱疹病毒ⅱ型的引物，如seq id no.11～12所示的核苷酸序列，taqman探针如seq id no.13所示的核苷酸序列；

8、用于检测水痘-带状疱疹病毒的引物，如seq id no.14～15所示的核苷酸序列，taqman探针如seq id no.16所示的核苷酸序列；

9、扩增并检测内标基因的特异性引物对和探针，如seq id no.17～19所示的核苷酸序列。

10、一种本发明所述的引物探针组在制备检测病毒adv、cmv、hsvⅰ、hsvⅱ和vzv产品中的应用。

11、一种含有本发明所述的引物探针组的眼科常见病毒的多重pcr检测试剂盒。该试剂盒实现同时对5种病毒的检测，所述的5种病毒相应的靶标基因分别为hsvi的ul3基因，hsvⅱ的ul3基因，cmv的ul83基因，adv的penton基因，vzv的orf29。

12、作为优选，所述检测试剂盒还包括pcrmix、阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品包含adv、cmv、hsvi、内标基因的目的扩增片段基因的质粒，所述阴性对照品包含内标基因目的扩增片段基因的质粒，用于监控每次扩增过程中仪器、扩增体系、操作是否正常；

13、进一步优选的是，所述的阳性对照包括adv、cmv、hsvi病毒相应的靶标基因经载体质粒puc57克隆dna，阴性对照包括含有内标基因序列目的扩增片段基因的质粒。

14、一种非诊断或治疗目的的眼科常见病毒的多重pcr检测方法，

15、s1、准备包含权利要求1所述的引物探针组的pcr反应体系；

16、s2、直接以采集的眼部样本为待测样本，采用试剂盒进行实时多重pcr扩增；

17、s3、分析pcr扩增结果，根据扩增反应结果判定病毒检测结果。

18、作为优选，待测样本包括眼部采集的房水、感染部位的结膜或角膜刮片样本。

19、作为优选，眼科常见病毒包括：腺病毒(adv)、人巨细胞病毒(cmv)、单纯疱疹病毒i型(hsvi)、水痘-带状疱疹病毒(vzv)和单纯疱疹病毒ⅱ型(hsvⅱ)。

20、作为优选，s2多重荧光pcr扩增的反应程序为：ung酶消化：25℃5min预变性：95℃5min；变性：95℃10s，退火延伸：58℃20s，共45个循环。

21、作为优选，s1中采用40μl pcr反应体系，

22、s1中采用40μl pcr反应体系，包括25μl pcrmix；5μl终浓度0.1-0.3μm的权利要求1所述的引物探针组。25μl pcr mix包含dna聚合酶、镁离子、脱氧核糖核苷酸(dntps)、尿嘧啶-dna糖基化酶(udg)和无菌无酶水，具体的是终浓度为：2u dna聚合酶、6mm镁离子、200μm脱氧核糖核苷酸(dntps)、0.01u尿嘧啶-dna糖基化酶(udg)和无菌无酶水。

23、进一步优选的是，40μl pcr反应体系中，各目标物检测所需上下游引物、探针具体是：

24、如seq id no.1～2所示的核苷酸序列的引物，终浓度0.2μm；

25、如seq id no.3～4所示的核苷酸序列的引物，终浓度0.1μm；

26、如seq id no.5～6所示的核苷酸序列的引物，终浓度0.3μm；

27、如seq id no.7所示的核苷酸序列的引物，终浓度0.1μm；

28、如seq id no.8～9所示的核苷酸序列的引物，终浓度0.2μm；

29、如seq id no.10所示的核苷酸序列的引物，终浓度0.1μm；

30、如seq id no.11～12所示的核苷酸序列的引物，终浓度0.2μm；

31、如seq id no.13所示的核苷酸序列的引物，终浓度0.1μm；

32、如seq id no.14～15所示的核苷酸序列的引物，终浓度0.2μm；

33、如seq id no.16所示的核苷酸序列的引物，终浓度0.1μm；

34、如seq id no.17～19所示的核苷酸序列的引物，终浓度0.1μm。

35、作为优选，s2中上样量为10μl。

36、本发明的有益效果在于：

37、1、本发明采用多重pcr技术，设计特异引物与taqman探针，基于taqman探针不同荧光基团的组合，可以对临床拟诊为病毒感染性眼病眼部组织标本同时进行5种病毒组合(adv、cmv、hsvi/hsvⅱ/vzv)的病原学检测。

38、2、本发明在反应体系具有极强的抗背景荧光干扰能力以及对内源性荧光淬灭剂的拮抗能力，核酸聚合酶和pcrmix具有极佳的抗逆性和适应性，不需要核酸模板的释放，能够在蛋白、多糖、盐离子等多种干扰pcr反应的复杂条件下保证酶活性和复制准确性。由于眼部标本量体积少，本发明针对的组织样本未经任何核酸富集处理，极大程度地缩短了样本检出结果的时间，采用10μl上样量完成检测，这要求反应体系有极高的灵敏度和扩增效率，且为后续的标本保留以及重复检测提供了保障。

39、3、本发明的试剂盒能对病人眼部采集的房水、感染部位的结膜、角膜刮片样本进行直接检测，不需要任何前处理，完成对5种眼部常见感染性病毒(腺病毒、人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒i型和ⅱ型、水痘-带状疱疹病毒)的检测。