一种靶向KRASG12V单链抗体片段、嵌合抗原受体CAR及应用

本发明涉及一种靶向kras g12v单链抗体片段、嵌合抗原受体car及应用，属于生物医药领域。

背景技术：

1、细胞治疗技术已成为近年来最引人注目的领域之一，它在癌症、血液疾病、心血管疾病、糖尿病和神经系统疾病等领域均展示出良好的治疗前景，在各种疾病尤其在肿瘤免疫治疗中发挥了重要作用，目前已有十余款免疫细胞疗法上市。免疫细胞治疗虽然在血液及淋巴系统肿瘤中表现出良好的治疗效果，但在实体瘤治疗领域仍具有一定的局限性。目前临床试验中使用的多为肿瘤相关抗原(taa)，如间皮素(msln)、表皮生长因子受体(egfr)、紧密连接蛋白claudin18.2(cldn18.2)等，但taa在部分正常组织中也有表达，这给细胞疗法带来了脱靶风险和安全性问题。因此，实体瘤高特异性靶点的选择是亟需解决的首要问题。

2、肿瘤抗原分为肿瘤相关抗原(tumor-associated antigens，taa)和肿瘤特异性抗原(tumor-specific antigen，tsa)。肿瘤相关抗原(taa)指指肿瘤细胞和正常细胞组织均可表达的抗原，只是其含量在细胞癌变时明显增高，此类抗原只表现出量的变化而无严格的肿瘤特异性。肿瘤特异性抗原(tsa)是指肿瘤细胞特有的或只存在于某种肿瘤细胞而不存在于正常细胞的一类抗原。肿瘤新抗原(neoantigen)是一种来源于非同义突变的肿瘤特异性抗原,是肿瘤免疫治疗中非常有吸引力的靶点。与taa不同，tsa/新抗原是从肿瘤基因组的遗传改变中获得的突变肽，在肿瘤细胞中特异表达，在正常组织中不存在，因此显示出很高的肿瘤特异性并降低了非靶向毒性。基于新抗原的个性化免疫疗法可以激发针对肿瘤细胞的强大的抗肿瘤免疫反应。

3、ras是第一个被发现的人类肿瘤基因，也是肿瘤中常见的突变基因，主要有三种亚型：hras、kras和nras。其中，kras是ras家族中最主要的突变型，并且与22％的人类肿瘤相关，是人类三大致命性癌症，肺癌(17％)，结直肠癌(33％)和胰腺癌(61％)中高频突变基因。在健康细胞中，kras是调节细胞生长的开关，在调节细胞增殖等多种细胞信号事件中发挥重要作用。然而，当kras基因发生突变时，kras会卡在“开启”位置，使细胞不受控制地生长并激活下游通路，导致细胞开始恶性增殖，引发癌症发生和转移。97％的kras突变发生在第12和13号密码子上，最常见的是kras g12c、g12d、g12v和g13d突变。其中g12v突变，已有临床研究证明其在多个癌种的免疫治疗中极具研究价值，是肿瘤免疫治疗的理想靶点。

4、嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)是一种人工合成的受体，能引导免疫细胞特异性地追踪识别和清除表达相关靶配体的肿瘤细胞，通常由能够识别肿瘤相关抗原的胞外结合域(一般来自单抗的抗原结合区的scfv片段)、铰链域、跨膜域和tcr分子的胞内信号域组成，具有高度靶向性。car以抗原依赖、非mhc(major histocompatibilitycomplex)限制的方式结合肿瘤抗原,这使得经过car改造的t细胞相较于天然t细胞表面受体tcr能够识别更广泛的肿瘤细胞。

5、hla-a*02等位基因在44％的高加索人群中表达，在中国人群中表达的比例高达37.7％，其中，hla-a*02:01在中国人群中的比例超过10％。通过netmhcpan-4.0生物信息学算法预测了hla-a*02:01和ras g12v突变蛋白的亲和力。传统的tcr-t可以识别由mhc递呈的胞内和胞外肿瘤抗原，对低水平突变的胞内抗原具有超敏感识别，但是有mhc限制性。而car-t/nk只能识别肿瘤细胞表面抗原。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明第一个目的，提供一种靶向kras g12v单链抗体片段，包括重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区包括vh-cdr1、vh-cdr2、vh-cdr3轻链可变区包括vl-cdr1、vl-cdr2、vl-cdr3；

2、其中，vh-cdr1氨基酸序列为seq id no：3所示的序列，vh-cdr2氨基酸序列为seqid no：4所示的序列，vh-cdr3氨基酸序列为seq id no：5所示的序列；

3、seq id no：3：gsyih；

4、seq id no：4：yidpeygysryadsvkg；

5、seq id no：5：dsdsdamdv；

6、vl-cdr1氨基酸序列为seq id no：8所示的序列，vl-cdr2氨基酸序列为seq idno：9所示的序列，vl-cdr3氨基酸序列为seq id no：10(qqyyypypt)所示的序列。

7、seq id no：8：rasqdvnvava；

8、seq id no：9：sssflys；

9、seq id no：10：qqyyypypt。

10、进一步地，所述重链可变区的全长氨基酸序列为seq id no：6所示的氨基酸序列；

11、seq id no：6：

12、asevqlesggglvqpggsllrscaasgfningsyihwvrqapgkglewv ayidpeygysryadsvkgrftiskntsadtaylqmnslrataedvyycsrdsd sdamdvwgqgtlvtvss；

13、或者如seq id no：7所示的氨基酸序列；

14、seq id no：7：

15、asevqlesgsglvqpggslrlsccasgfhnigsyihwvaqpagkglkwvr yidpeygysryadsvkgrfaisadmskntaylqmnslraedtavyyysrdsd sdamdvwgqgtlvvvss；

16、所述轻链可变区的全长氨基酸序列为seq id no：11所示的氨基酸序列；

17、seq id no：11：

18、diqmtqsssslsasvgdrvtitcrasqdvnvavawyqqkpgkapklliyss sflysgvpsrfsgsrsgtdftlsslqtipedfatyycqqyyypyptfgtgqkvei krt；

19、或者如seq id no：12所示的氨基酸序列。

20、seq id no：12：

21、diqmtqmpsslsasvgdrvtiacrasqdvnvavawyqqkpgkapklilys ssflysgvpsrfsrfgsgqdftttisslqpedfataycqqyyypyptfgagqkv eikrt；

22、进一步地，所述重链可变区和轻链可变区由连接区连接，连接区由3个四肽多聚体组成，氨基酸序列如seq id no：13所示。

23、seq id no：13：gggsggggsggg。

24、进一步地，单链抗体可变区的氨基酸序列如seq id no：14所示或者至少80％的同源性序列；

25、seq id no：14：

26、diqmtqsssslsasvgdrvtitcrasqdvnvavawyqqkpgkapklliysssflysgvpsrfsgsrsgtdftlsslqtipedfatyycqqyyypyptfgtgqkveikrtgggsggggsgggasevqlesggglvqpggsllrscaasgfningsyihwvrqapgkglewvayidpeygysryadsvkgrftiskntsadtaylqmnslrataedvyycsrdsdsdamdvwgqgtlvtvss；

27、或者如seq id no：15所示或者至少80％的同源性序列。

28、seq id no：15：

29、diqmtqmpsslsasvgdrvtiacrasqdvnvavawyqqkpgkapklilysssflysgvpsrfsrfgsgqdftttisslqpedfataycqqyyypyptfgagqkveikrtgggsggggsgggasevqlesgsglvqpggslrlsccasgfhnigsyihwvaqpagkglkwvryidpeygysryadsvkgrfaisadmskntaylqmnslraedtavyyysrdsdsdamdvwgqgtlvvvss；

30、本发明的第二个目的，提供一种嵌合抗原受体car，包括抗原结合结构域、跨膜结构域、胞内信号结构域；其中抗原结构域包括信号肽、myc标签和识别抗原的权利要求1-3所示的单链抗体片段。

31、进一步地，所述信号肽为cd8、gm-csf、cd4、cd28、cd137、或其突变体/修饰体、或其组合。

32、进一步地，所述信号肽为cd8，氨基酸序列如seq id no：1所示。

33、seq id no：1：malpvtalllplalllhaarp；

34、进一步地，所述的myc标签是一种来源于c-myc基因的表位标签，作为一种融合蛋白可融合至单链抗体片段的n端或c端，其氨基酸序列如seq id no：2所示。

35、seq id no：2：eqkliseedl。

36、进一步地，所述myc标签融合在单链抗体片段的n端。

37、进一步地，所述抗原结合结构域和跨膜结构域通过铰链区相连，铰链区选自cd8α、cd28胞外结构域的衍生物、由igg1或igg4的fc部分或fc部分的ch2/ch3结构域组成的基于igg的铰链区、或dap12。

38、进一步地，所述铰链区为cd8α，其氨基酸序列如seq id no：16所示。

39、seq id no：16：

40、tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd。

41、进一步地，所述跨膜结构域选自cd3ζ、cd8、cd28、nkg2d、2b4、dnam1中的一种。

42、进一步地，所述跨膜结构域为cd28或cd8；其中，cd28跨膜区的氨基酸序列如seqid no：17所示；

43、seq id no：17：

44、fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs；

45、或/和

46、cd8跨膜区的氨基酸序列如seq id no：18所示。

47、seq id no：18：iyiwaplagtcgvlllslvitlyc。

48、进一步地，所述胞内信号结构域选自cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b、cd66d、cd2、cd4、cd5、cd28家族、dap10、dap12、nkp44、nkg2d、tnfr家族或slam相关受体家族中的一种或多种。

49、进一步地，所述胞内信号结构域为4-1bb和cd3ζ的组合；其中，4-1bb的氨基酸序列如seq id no：19所示，cd3ζ的氨基酸序列如seq id no：20所示。

50、seq id no：19：

51、krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel；

52、seq id no：20：

53、rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggk prrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkd tydalhmqalppr。

54、本发明的第三个目的，提供一种表达上述嵌合抗原受体car的car-t细胞。

55、本发明的第四个目的，提供一种上述靶向kras g12v单链抗体片段、嵌合抗原受体car、car-t细胞在制备抗肿瘤药品或产品中的应用。

56、本发明所达到的有益技术效果：本发明提高一种靶向kras g12v单链抗体片段、嵌合抗原受体car及应用，基于kras g12v靶点，对tcr进行改造。保留tcr识别肿瘤特异性抗原的胞外信号区，和传统car结构中的胞外间隔区、跨膜区以及cd3ζ胞内信号域串联，使改造后的嵌合抗原受体car能够特异性识别hla-a*02:01递呈的kras g12v突变多肽。同时，借助car-t/nk细胞治疗的优势，探索潜在的肿瘤治疗新方案，为临床试验奠定基础。