一种IS200/IS60S转座子ISCB突变蛋白及其应用

本发明属于基因编辑，具体而言，本发明涉及一种is200/is60s转座子iscb突变蛋白及其应用。

背景技术：

1、crispr/cas技术是一种被广泛使用的基因编辑技术，它通过rna引导对基因组上的靶序列进行特异性结合并切割dna产生双链断裂，利用生物非同源末端连接或同源重组进行定点基因编辑。

2、作为广泛使用的基因组编辑工具，spcas9和cas12a能够在多种细胞种类和生物中起作用。它们可以用于全基因组筛选来研究基础生物功能，或者发现和验证复杂遗传病的潜在药物靶点。在临床试验中，cas核酸酶经过递送可以治疗由已知遗传因素导致的疾病，例如在杜氏肌营养不良症(dmd)中，使用基因编辑可以修正基因突变或者诱发转录过程跳过有缺陷的外显子。

3、而aav是一种在体内表达目标基因的有效和安全的载体，已广泛用于基因治疗，它的容量大概是4.7kb。传统的spcas9、cas12a等核酸酶虽然活性高具有良好的编辑功能，但它们的分子尺寸相比之下都过大。举例来说，广泛使用的spcas9蛋白由1000-1400个氨基酸组成，无法进行aav包装，必须通过内含肽进行拆分，而如果利用两个aav进行递送，导致spcas9活性下降；相关的病毒滴度及后续可能多次注射可能会使机体产生抗体等问题的出现。这就限制了这些系统在基因治疗等领域的应用。

4、2021年，science杂志刊登公开了一种由is200/is605转座子家族编码的rna引导的核酸酶(iscb)。从蛋白结构预测分析中，iscb同样存在ruvc和hnh两个结构域。通过体外dna切割实验，研究者发现iscb具备由ωrna引导识别并切割特定dna双链序列的能力，其pam序列也被作者称为tam(target-adjacent motif)。

5、iscb已经具备了很多spcas9的优点，比如有两个酶活性位点，分别负责一条dna单链的切割；又比如ωrna的结构较为复杂，便于进行改造。而iscb相比spcas9最大的优势在于其非常小的体积，仅由500个左右的氨基酸组成，为递送提供了极大的便利，同时也就腾出了巨大的改造空间。

6、但是iscb蛋白在真核细胞中整体编辑效率较低，本技术对is200/is605转座子家族编码的rna引导的核酸酶(iscb)进行了优化，实现更高效的编辑，为递送提供更多选择，进一步拓宽了基因编辑技术在临床治疗方面的应用。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种iscb突变蛋白及其应用。本发明经过大量实验和反复摸索，通过一种基于可突变位点的算法对iscb蛋白进行位点预测突变，提高了其编辑活性，扩展了其应用范围。

2、本发明中，氨基酸残基可以用单字母表示，也可以用三字母表示，例如：丙氨酸(ala，a)，缬氨酸(val，v)，甘氨酸(gly，g)，亮氨酸(leu，l)，谷酰胺酸(gln，q)，苯丙氨酸(phe，f)，色氨酸(trp，w)，酪氨酸(tyr，y)，天冬氨酸(asp，d)，天冬酰胺(asn，n)，谷氨酸(glu，e)，赖氨酸(lys，k)，甲硫氨酸(met，m)，丝氨酸(ser，s)，苏氨酸(thr，t)，半胱氨酸(cys，c)，脯氨酸(pro，p)，异亮氨酸(ile，i)，组氨酸(his，h)，精氨酸(arg，r)。

3、术语“axxb”表示第xx位的氨基酸a变为氨基酸b，例如a401r表示第401位的a突变为r。多个氨基酸位点同时存在突变时，可以采用a401r-s456r类似的形式进行表述，例如，a401r-s456r代表第401位a突变为r同时第456位s突变为r。

4、本发明解决其技术问题采用的技术方案是：

5、第一方面，本发明提供了一种iscb突变蛋白，所述突变蛋白与如seq id no:1所示的野生型iscb蛋白相比，在以下任一个或多个氨基酸位点处存在突变：第17位、第21位、第25位、第34位、第40位、第51位、第107位、第122位、第135位、第140位、第150位、第152位、第153位、第154位、第160位、第161位、第197位、第198位、第300位、第301位、第376位、第377位、第383位、第401位、第402位、第403位、第418位、第422位、第432位、第456位、第459位、第460位、第468位、第485位，且所述突变均突变为精氨酸。

6、在具体的实施方案中，编码野生型iscb蛋白的核酸分子，其核苷酸序列如seq idno:2所示。

7、在具体的实施方案中，所述iscb突变蛋白为将野生型iscb蛋白的第376位氨基酸突变为精氨酸，且将第456位氨基酸突变为精氨酸得到的蛋白质。

8、在更具体的实施方案中，编码前文所述iscb突变蛋白的核酸分子，具有以下任一核苷酸序列：

9、(1)seq id no.3所示的核苷酸序列；或，

10、(2)seq id no.3所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；或，

11、(3)与seq id no.3所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的序列。

12、在另一个具体的实施方案中，所述iscb突变蛋白为将野生型iscb蛋白的第401位氨基酸突变为精氨酸，且将第456位氨基酸突变为精氨酸得到的蛋白质。

13、在更具体的实施方案中，编码前文所述iscb突变蛋白的核酸分子，具有以下任一核苷酸序列：

14、(1)seq id no.4所示的核苷酸序列；或，

15、(2)seq id no.4所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；或，

16、(3)与seq id no.4所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的序列。

17、第二方面，本发明保护一种融合蛋白，所述融合蛋白包括前文任一所述的突变蛋白以及其他的修饰部分。

18、在具体的实施方案中，所述融合蛋白还包含优化的核定位信号序列，优选1xmycnls。

19、在具体的实施方案中，本发明保护一种核酸分子，其编码前文所述的融合蛋白。

20、第三方面，本发明保护一种组合物，所述组合物包括：

21、1)第一核酸，其为编码上述蛋白的核酸分子；和

22、2)第二核酸，其为导向rna，即本发明中所述的omigarna(obligate mobileelement–guided activity rna)，所述omigarna根据靶基因序列设计构建。

23、在具体的实施方案中，所述组合物包括iscb mrna和omigarna；所述iscb mrna为seq id no.1的转录本；seq id no.5在seq id no.2的基础上增加了c端一侧的1xmyc nls序列。

24、第四方面，本发明还提供了一种由is200/is605转座子家族编码的rna引导的核酸酶(iscb)系统，其特征在于，所述系统包括：

25、(1)蛋白组分，其选自：前文所述的iscb突变蛋白、前文所述iscb突变蛋白的衍生化蛋白或融合蛋白，及其任意组合；

26、(2)核酸组分，其为omigarna，所述omigarna能够结合(i)所述蛋白组分，并引导蛋白组分至目标基因靶序列的grna核酸序列；所述蛋白组分与核酸组分相互结合形成组合物。

27、第五方面，本发明还保护前文任一所述的突变蛋白，或前文任一所述的融合蛋白，或前文所述的核酸分子，或前文所述的系统，在基因编辑中的应用，所述应用为非疾病诊断和治疗目的的应用。

28、在具体的实施方案中，所述基因编辑为基因敲除或基因敲入。

29、第六方面，本发明保护前文任一所述的突变蛋白，或前文任一所述的融合蛋白，或前文所述的核酸分子，或前文所述的系统，在制备制剂中的用途，所述制剂用于：

30、(i)基因或基因组编辑；

31、(ii)靶核酸检测和/或诊断；

32、(iii)编辑靶基因座中的靶序列来修饰生物；

33、(iv)疾病的治疗；

34、(v)靶向靶基因；

35、(vi)切割目的基因。

36、本发明的有益效果在于：

37、(1)本发明可以在多个内源性位点进行高效的基因敲除及基因敲入。

38、(2)本发明的iscb系统结构很小，便于aav的递送，为解决包装体积限制提供思路，增加在基因治疗领域的应用可能。

39、(3)iscb具有两个活性切割结构域，基于本发明优化的iscb蛋白的基础上可以做nickase单链编辑。

40、(4)本发明可以用来构建基因突变致病动物模型，针对罕见病突变位点进行敲除。