一种检测过氧亚硝酸盐的荧光探针及其制备方法与使用方法

本发明属于有机小分子荧光探针领域，具体涉及一种作为过氧亚硝酸盐荧光探针使用的2-氨基-3-(((e)-5-((e)-2-(3-(二氰亚甲基)-5,5-二甲基环己烯基)乙烯基)-2-羟基亚苄基)氨基)马来腈及其制备方法与使用方法。

背景技术：

1、过氧亚硝酸盐(onoo-)是一种典型的内源性活性氮，通常是由高活性自由基一氧化氮(·no)和超氧化物(o2·-)在生物体内原位产生，具有高氧化、高硝化活性。基于这些特性，它表现出双向效应:(i)积极的：过氧亚硝酸盐是生物体内必不可少的生理激活剂和信号分子。在正常生理条件下，onoo-作为一种信号分子调节一系列生理稳态。onoo-有助于调节生物体的动态氧化还原稳态，抵抗外源微生物入侵。它还可以调节细胞内氧化还原敏感的转录因子，并影响后续基因的表达。(ii)消极的：当onoo-水平超过合理值时，生命系统可能无法反应和利用这些多余的onoo-，导致细胞的氧化还原状态变为促氧化状态。这种状态诱导生物分子的氧化，导致对细胞器和亚细胞器的损害最终诱发严重的炎症和疾病，如心血管疾病、神经退行性疾病、阿尔茨海默病，甚至癌症。因此，开发一种快速、灵敏、选择性检测onoo-的方法，有助于我们更好地研究onoo-在生物化学中的动态作用，也有助于疾病的早期诊断和治疗，具有重要的意义。

2、荧光检测法由于其优秀的检测灵敏度和选择性，并能实现对待测样品的实时、在线检测而受到研究者的广泛关注。

3、目前已开发的用于检测过氧亚硝酸盐的小分子荧光探针主要是利用过氧亚硝酸盐的选择性氧化反应、脱保护反应和氧化裂解反应等作为依据而设计。当存在过氧亚硝酸盐的条件下，探针分子中的检测基团与过氧亚硝酸盐发生特异性反应，改变了分子原有的pet或ict效应，导致探针分子的荧光性质发生变化，从而实现对过氧亚硝酸盐的特异性识别。

4、然而，基于反应型的过氧亚硝酸盐荧光探针(参见综述,q.ma,s.xu,z.zhai,k.wang,x.liu,h.xiao,s.zhuo,y.liu,chem.eur.j.2022,28,e202200828.)，其中包括将含苯硼酸或苯硼酸酯氧化为酚类化合物，将肟或腙选择性地氧化水解等已成为过氧亚硝酸盐荧光探针常用的选择性识别机制。而这些已报道探针仍存在荧光团稳定性差，或合成困难，或检测波长短，或不能被用来可视化实时系统中过氧亚硝酸盐的波动等不足，不利于其在复杂体系内对过氧亚硝酸盐动态水平的准确评估。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中的上述缺陷，本发明提出了一种定量检测过氧亚硝酸盐的荧光开启型荧光探针(dci-oh-damn)。利用本发明可对样品中极微量的过氧亚硝酸盐进行定量检测。

2、本发明的核心在于利用(e)-2-(3-甲酰基-4-羟基苯乙烯基)-5，5-二甲基环己基-2-烯-1-亚基丙二腈构筑经典的分子内电荷转移(ict)体系。探针本身具有良好的ict效应几乎没有荧光发生，但当存在过氧亚硝酸盐的条件下，过氧亚硝酸盐与探针分子上的亚胺部分发生氧化水解反应而断裂生成醛基，进而阻断了分子的ict效应，探针分子发射出强的红色荧光，通过上述方案，获得了“开启”型的荧光响应，实现了对过氧亚硝酸盐的高灵敏、特异性检测。

3、本发明所述过氧亚硝酸盐荧光探针命名为dci-oh-damn，其分子式为c24h20n6o，结构式如式(i)所示：

4、

5、上述荧光探针的制备方法如下：将一定量的(e)-2-(3-甲酰基-4-羟基苯乙烯基)-5，5-二甲基环己基-2-烯-1-亚基丙二腈，二氨基马来腈和冰醋酸溶于无水乙醇中，反应一定时间，然后过滤后得到化合物2-氨基-3-(((e)-5-((e)-2-(3-(二氰亚甲基)-5,5-二甲基环己烯基)乙烯基)-2-羟基亚苄基)氨基)马来腈，即：dci-oh-damn。

6、上述探针的制备反应式如下：

7、

8、作为优选，所述的(e)-2-(3-甲酰基-4-羟基苯乙烯基)-5，5-二甲基环己基-2-烯-1-亚基丙二腈、二氨基马来腈、冰醋酸的摩尔比为1:1～2:3～5；(e)-2-(3-甲酰基-4-羟基苯乙烯基)-5，5-二甲基环己基-2-烯-1-亚基丙二腈与无水乙醇的质量体积比为1:10～200；反应温度为0～50℃，反应时间为1～24小时。

9、作为优选，所述的(e)-2-(3-甲酰基-4-羟基苯乙烯基)-5，5-二甲基环己基-2-烯-1-亚基丙二腈、二氨基马来腈、冰醋酸的摩尔比为1:1:3。

10、作为优选，所述的(e)-2-(3-甲酰基-4-羟基苯乙烯基)-5，5-二甲基环己基-2-烯-1-亚基丙二腈与无水乙醇的质量体积比为:100。

11、作为优选，所述的反应温度为50℃。

12、作为优选，反应时间为24小时。

13、上述过氧亚硝酸盐荧光探针的使用方法如下：

14、步骤1：向不同浓度过氧亚硝酸盐的磷酸缓冲溶液(10mm,ph＝7.4)中加入相同浓度的式(i)所示化合物，配置至少5种不同过氧亚硝酸盐含量的含有式(i)所示化合物的标准溶液；

15、所示标准溶液中式(i)所示化合物的浓度为1nm～10μm；

16、所示标准溶液中过氧亚硝酸盐的含量为0.1nm～1mm；

17、步骤2：分别测定所述标准溶液的荧光发射光谱，激发波长为532nm，以过氧亚硝酸盐浓度为横坐标，以i653为纵坐标，建立标准曲线；

18、i653表示所述标准溶液在波长为653nm处的荧光发射峰强度值；

19、步骤3：向待测样品中加入式(i)所示化合物，控制其浓度与所述标准溶液中式(i)所示化合物的浓度相等；测定其在激发波长为532nm的激发光下的荧光发射谱，即根据标准曲线计算得出待测样品的过氧亚硝酸盐含量。

20、本发明具有如下特点：

21、1)本发明提供的荧光探针是棕色固体粉末，结构稳定。

22、2)本发明提供的荧光探针，其溶液对过氧亚硝酸盐的浓度敏感，随着过氧亚硝酸盐浓度的增加，紫外灯下观察到其水溶液的荧光由微弱的荧光变为明亮的红色荧光。

23、3)本发明提供的荧光探针，其发射波长为653nm，为荧光“开启”型响应，且反应前后荧光强度变化较大(约30倍)，能大大消除检测时检测条件差异对结果的影响，提高检测的灵敏度。

24、4)本发明提供的荧光探针对过氧亚硝酸盐浓度呈线性关系，可用于过氧亚硝酸盐浓度的精确测量。

25、本发明提供的基于二氰基异佛尔酮染料的“开启”型过氧亚硝酸盐探针，对过氧亚硝酸盐溶液具有良好的响应，能够实现对样品内过氧亚硝酸盐的灵敏定量检测，具有操作简便，成本低廉，响应灵敏，易于推广和应用等优点。

技术特征：

1.一种检测过氧亚硝酸盐的荧光探针,其特征在于：其分子式为c24h20n6o，简称dci-oh-damn，结构式为式(i)；

2.根据权利要求1所述的一种检测过氧亚硝酸盐的荧光探针的制备方法，其特征在于，合成步骤如下：

3.根据权利要求2所述的一种检测过氧亚硝酸盐的荧光探针的制备方法，其特征在于：

4.根据权利要求2或3所述的一种检测过氧亚硝酸盐的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述的(e)-2-(3-甲酰基-4-羟基苯乙烯基)-5，5-二甲基环己基-2-烯-1-亚基丙二腈、二氨基马来腈、冰醋酸的摩尔比为1:1:3。

5.根据权利要求2或3所述的一种检测过氧亚硝酸盐的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述的(e)-2-(3-甲酰基-4-羟基苯乙烯基)-5，5-二甲基环己基-2-烯-1-亚基丙二腈与无水乙醇的质量体积比为1:100。

6.根据权利要求2或3所述的一种检测过氧亚硝酸盐的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述的反应温度为50℃。

7.根据权利要求2或3所述的一种检测过氧亚硝酸盐的荧光探针的制备方法，其特征在于：反应时间为24小时。

8.根据权利要求1所述的额一种检测过氧亚硝酸盐的荧光探针的使用方法；其特征在于：

技术总结
本发明公开了一种检测过氧亚硝酸盐的荧光探针及其制备方法与使用方法。本发明利用(E)‑2‑(3‑甲酰基‑4‑羟基苯乙烯基)‑5，5‑二甲基环己基‑2‑烯‑1‑亚基丙二腈构筑经典的分子内电荷转移(ICT)体系。探针本身具有良好的ICT效应几乎没有荧光发生，但当存在过氧亚硝酸盐的条件下，过氧亚硝酸盐与探针分子上的亚胺部分发生氧化水解反应而断裂生成醛基，进而阻断了分子的ICT效应，探针分子发射出强的红色荧光。本发明提供的二氰基异佛尔酮类染料的开启型过氧亚硝酸盐探针对过氧亚硝酸盐溶液具有良好的响应，能够实现对样品内微量过氧亚硝酸盐的灵敏、定量检测，具有操作简便，成本低廉，响应灵敏，易于推广和应用等优点。

技术研发人员：韩益丰,张得灵
受保护的技术使用者：浙江理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15