一种赖氨酸位点突变的KMO蛋白突变体的应用

本申请涉及生物化学，尤其涉及一种赖氨酸位点突变的kmo蛋白突变体的应用。

背景技术：

1、抗氧化防御能力的下降使人和动物容易遭受氧化应激导致的肝脏损伤和疾病，给人类健康和畜牧生产造成巨大损失。犬尿氨酸-3-单加氧酶(kynurenine-3-monooxygenase，kmo)是色氨酸代谢通路上的一种重要的代谢酶和药物靶点，可以将犬尿氨酸(kynurenine，kyn)羟基化为3-羟基犬尿氨酸(3-hydroxykynurenine，3-hk)，该化合物可以通过犬尿氨酸酶(kynureninase，kynu)进一步羟基化形成3-羟基邻氨基苯甲酸(3-hydroxyanthranilic acid，3-haa)。3-haa和3-羟基犬尿氨酸(3-hydroxykynurenine，3-hk)都是自由基发生器和神经毒性代谢产物，因此可导致氧化应激和神经变性。2-氨基-3-羧基粘康酸半醛(2-amino-3-carboxymuconate semialdehyde，acms)是在3-羟基邻氨基苯甲酸酯-3，4-双加氧酶(3-hydroxyanthranilate-3,4-dioxygenase，haao)的催化下进一步沿着该途径形成的。acms可形成nad+前体喹啉酸(quin)并最终生成nad+。因此，kmo在确保促氧化剂(quin，3-hk，吡啶甲酸)和抗氧化剂犬尿酸(kynurenic acid，kyna)等犬尿氨酸代谢产物之间的平衡方面起着关键作用。

2、kmo位于线粒体外膜，其表达主要局限于肝脏、肾脏、一些单核细胞和大脑内的小胶质细胞。kmo的抑制将kyn的代谢从3-hk分流到kyna，且已被发现可使病理性kp失衡正常化并改善疾病表型。并且，与野生型相比，kmo敲除则对应的小鼠肝脏中的3-hk水平降低，但kyn、kyna和邻氨基苯甲酸(anthranilic acid，aa)水平增加。此外，kmo抑制已显示可增强犬尿氨酸氨基转移酶(kynurenine aminotransferase，kats)活性，促进其催化产物kyna的生成。

3、相反地，kmo的上调将导致具有活性氧(reactive oxygen species，ros)生成特性的代谢物的形成，研究发现，与正常肝细胞系l02相比，kmo在人肝癌细胞hcc中的表达异常升高，而kmo敲除可以显著降低hcc细胞在体外的迁移和侵袭率，且从肝硬化发展到肝癌过程中，肝组织的kmo表达逐渐增加。

4、因此，kmo蛋白的表达对提高人体和动物的机体抗氧化水平和健康状况密切相关，对其表达调控的研究具有重要意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本申请的目的在于提出一种赖氨酸位点突变的kmo蛋白突变体的应用。

2、基于上述目的，本申请一种赖氨酸位点突变的kmo蛋白突变体的应用，所述kmo蛋白突变体的赖氨酸位点发生突变，所述赖氨酸位点包括第67位的赖氨酸k67、第93位的赖氨酸k93和第179位的赖氨酸k179中的至少一个。

3、可选地，所述突变为：由赖氨酸突变为精氨酸。

4、可选地，通过全基因合成获得所述突变体的目的基因序列，而后根据所述突变体的目的基因序列进行pcr扩增，所述扩增所用引物包括：

5、上游引物：5’-ctggctagcgtttaaacttaagcttgccaccatggactc atctgtcattcaaagg-3’；

6、下游引物：5’-tttaaacgggccctctagactcgagtcacctgctaatg agattggaaatttg-3’。

7、可选地，所述kmo蛋白突变体用于提升kmo蛋白的表达。

8、可选地，所述kmo蛋白突变体在筛选预防和/或治疗肝癌的药物中的应用。

9、从上面所述可以看出，本申请提供的赖氨酸位点突变的kmo蛋白突变体的应用，通过将kmo蛋白的赖氨酸位点第67位的赖氨酸k67、第93位的赖氨酸k93和第179位的赖氨酸k179发生突变，以调控kmo蛋白的表达，试验结果证明，kmo蛋白的赖氨酸位点发生突变可以提高kmo蛋白表达，伴随目标细胞抗氧化能力的显著降低，可以用作细胞kmo蛋白表达水平及抗氧化能力调控等相关研究的细胞模型。

技术特征：

1.一种赖氨酸位点突变的kmo蛋白突变体的应用，其特征在于，所述kmo蛋白突变体的赖氨酸位点发生突变，所述赖氨酸位点包括第67位的赖氨酸k67、第93位的赖氨酸k93和第179位的赖氨酸k179中的至少一个。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述突变为：由赖氨酸突变k为精氨酸r。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过全基因合成获得所述突变体的目的基因序列，而后根据所述突变体的目的基因序列进行pcr扩增，所述扩增所用的引物包括：

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述kmo蛋白突变体用于提升kmo蛋白的表达。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述kmo蛋白突变体在筛选预防和/或治疗肝癌的药物中的应用。

技术总结
本申请提供一种赖氨酸K位点突变的KMO蛋白突变体的应用，所述KMO蛋白突变体的赖氨酸位点发生突变，所述赖氨酸位点包括第67位的赖氨酸K67、第93位的赖氨酸K93和第179位的赖氨酸K179中的至少一个。通过将KMO蛋白的赖氨酸位点K67、K93和K179发生突变，可以调控KMO蛋白的表达，试验结果证明，KMO蛋白的赖氨酸位点发生突变可以提高KMO蛋白表达，将该突变体应用于目标细胞时，可以用作细胞KMO蛋白表达水平及抗氧化能力调控等相关研究的细胞模型。

技术研发人员：高杰,顾宪红,郝月,朴香淑
受保护的技术使用者：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16