一种诱导小鼠肠道类器官定向分化为肠内分泌细胞的培养基及其应用

本发明属于类器官诱导培养，具体为一种诱导小鼠肠道类器官定向分化为肠内分泌细胞的培养基及其应用

背景技术：

1、小肠内分泌细胞由小肠干细胞分化而来，分布于整个肠道，调控肠道分泌、运动、消化吸收、血糖调节和代谢等生理活动。它能够分泌不同类型的肠道激素，通过内分泌和旁分泌等途径，在肠道蠕动、血管收缩、营养吸收、上皮生长以及中枢生物节律调控等方面发挥关键作用。同时面向医药、营养和组织工程的非临床和临床系统的研究担任重要角色。在过去，关于肠内分泌细胞的体外研究始终停留在细胞系水平，以单层形式培养，与正常的肠内分泌细胞在细胞环境、遗传背景和功能特性上存在较大差异。

2、研究表明，肠道中的lgr5+肠道干细胞具有分化为肠上皮中所有类型的细胞的潜能，包括潘氏细胞、内分泌细胞、肠上皮细胞等。因此提取小肠隐窝中的lgr5+肠道干细胞，加以诱导便能形成可以自我维持和增殖的肠道类器官。该类器官内含所有肠道上皮细胞类型，拥有和肠道相似的细胞环境，另外其中肠道激素的表达方式与天然肠道相似。但是在肠道类器官中，肠内分泌细胞只占1％，考虑到目前的培养方式难以通过控制其具体的分化方向进而得到肠内分泌细胞群，因此，亟需发展一种稳定、高效、便捷的小鼠肠道内分泌细胞诱导模型构建方法。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种诱导培养基，所述诱导培养基处理小鼠小肠类器官能够成功且快速地使其定向分化为成熟肠内分泌细胞。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供了一种诱导培养基，所述培养基组分包括肠道类器官标准条件enr培养基10～15ml、mek抑制剂pd03259010.5～2μm、wnt抑制剂iwp-23～8μm和notch抑制剂dapt8～15μm；所述enr培养基组分为advanced dmem培养基10～15ml，glutamax 100～150μl、hepes buffer 100～150μl、n-2supplement 100～150μl、b-27supplement 100～150μl、青链霉素100～150μl，noggin 80～120ng/ml、r-spondin1400～600ng/ml、egf 30～80ng/ml。

4、本发明还提供了一种诱导小鼠肠道类器官定向分化为肠内分泌细胞的方法，包括如下步骤：使用所述的诱导培养基培养小鼠小肠类器官。

5、优选地，所述培养的条件为35～37℃，5％co2。

6、优选地，当小鼠小肠类器官分化开始每2天更新一次培养基；分化4天后，吸去培养液，加入pbs缓冲液吹打、离心、弃上清，重悬于4℃advanced dmem中，离心、弃去上清，重悬于advanced dmem和matrigel基质胶中。

7、更优选地，所述离心的条件为0～4℃，280～290g离心2～8min。

8、优选地，所述小鼠小肠类器官是由小鼠小肠隐窝干细胞于肠道类器官标准条件enr培养基中培养5～7天后传代培养得到。

9、更优选地，所述肠道类器官标准条件enr培养基组分为advanced dmem培养基10～15ml，glutamax 100～150μl、hepes buffer 100～150μl、n-2supplement 100～150μl、b-27supplement 100～150μl、青链霉素100～150μl，noggin 80～120ng/ml、r-spondin1400～600ng/ml、egf 30～80ng/ml。

10、更优选地，所述传代比例为1：3～1：5。

11、更优选地，所述小鼠小肠隐窝干细胞是小鼠小肠组织经edta消化处理获得。

12、本发明还提供了一种所述诱导培养基或所述方法在构建小鼠肠内分泌细胞类器官模型中的应用。

13、相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

14、本发明提供的诱导培养基通过将小鼠小肠类器官定向分化为肠内分泌细胞。通过免疫荧光检测，与对照组相比，本发明诱导培养基处理的肠内分泌细胞标记物数量提升985％；通过qrt-pcr检测类器官中各种细胞标志物mrna表达量，cck(i细胞)、glp-1(l细胞)、ghrelin(a细胞)、secrtin(s细胞)、gip(k细胞)和somatostatin(d细胞)等小肠常见内分泌细胞亚型的标记激素mrna表达量均有大幅上升。结果表明，本发明的诱导培养基处理小鼠小肠类器官能够成功地使其定向分化为成熟肠内分泌细胞，利于成功构建小鼠肠道内分泌细胞诱导模型。该模型可较2d细胞模型更好地模拟肠道细胞环境，用于探究不同疾病模型对肠内分泌细胞及其肠道激素分泌的影响及分子机制，也可用于研究肠道营养与健康、肠道内分泌疾病药物筛选及安全性评价。

技术特征：

1.一种诱导培养基，其特征在于，所述培养基组分包括肠道类器官标准条件enr培养基10～15ml、mek抑制剂pd03259010.5～2μm、wnt抑制剂iwp-23～8μm和notch抑制剂dapt8～15μm；所述enr培养基组分为advanceddmem培养基10～15ml，glutamax100～150μl、hepesbuffer100～150μl、n-2supplement100～150μl、b-27supplement100～150μl、青链霉素100～150μl，noggin80～120ng/ml、r-spondin1400～600ng/ml、egf 30～80ng/ml。

2.一种诱导小鼠肠道类器官定向分化为肠内分泌细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：使用权利要求1所述的诱导培养基培养小鼠小肠类器官。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养的条件为35～37℃，5％co2。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，当小鼠小肠类器官分化开始每2天更新一次培养基；分化4天后，吸去培养液，加入pbs缓冲液吹打、离心、弃上清，重悬于4℃advanceddmem中，离心、弃去上清，重悬于advanceddmem和matrigel基质胶中。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述离心的条件为0～4℃，280～290g离心2～8min。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述小鼠小肠类器官是由小鼠小肠隐窝干细胞于肠道类器官标准条件enr培养基中培养5～7天后传代培养得到。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述肠道类器官标准条件enr培养基组分为advanceddmem培养基10～15ml，glutamax100～150μl、hepesbuffer100～150μl、n-2supplement100～150μl、b-27supplement100～150μl、青链霉素100～150μl，noggin80～120ng/ml、r-spondin1400～600ng/ml、egf30～80ng/ml。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述传代比例为1：3～1：5。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述小鼠小肠隐窝干细胞是小鼠小肠组织经edta消化处理获得。

10.权利要求1所述诱导培养基或权利要求2～9任意一项所述方法在构建小鼠肠内分泌细胞类器官模型中的应用。

技术总结
本发明提供了一种诱导小鼠肠道类器官定向分化为肠内分泌细胞的培养基及其应用，涉及类器官诱导培养技术领域。本发明在小鼠小肠类器官标准条件(ENR)培养基中加入Mek抑制剂PD0325901、Wnt抑制剂IWP‑2、Notch抑制剂DAPT诱导小鼠小肠类器官向成熟的肠内分泌细胞分化，实现小鼠肠道内分泌细胞诱导模型的构建。

技术研发人员：吴文达,徐宝才,秦子慧,乐建铭,张杰,李图帅,张华月
受保护的技术使用者：合肥工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13