一种基于原生质体融合技术生产2-酮基-L-古龙酸的方法

本发明涉及生物，具体是一种基于原生质体融合技术生产2-酮基-l-古龙酸的方法。

背景技术：

1、2-酮基-l-古龙酸(2-kga)是合成维生素c的前体物质。维生素c是一种酸性多羟基化合物，是动植物界广泛存在的维生素之一，其具有抗氧化特性，在人体胶原蛋白合成、清除活性氧、美容养颜、预防脱发、增强身体机能等方面起到重要作用。但是，人体不具备合成维生素c的能力，因此必须通过外界摄入。国内维生素c生产方式主要为三菌两步发酵法，即先通过细菌发酵将d-山梨醇转化成l-山梨糖，再以l-山梨糖为底物，通过伴生菌和产酸菌进一步生成2-kga，最后通过烯醇化、内酯化等一系列化学反应异化成维生素c；相比国外的“莱氏法”，三菌两步发酵法具有底物消耗量少、生产安全性高、成本低的优点，但该方法存在二次灭菌、二次发酵的问题，工艺控制比较困难。

2、另外，2-kga的生产方式还包括三菌一步发酵法，即将氧化葡萄糖酸杆菌、伴生菌和产酸菌混合一步发酵，但其中的原理与三菌两步发酵方法相同，实质上都是分为两步催化，即先通过细菌发酵将d-山梨醇转化成l-山梨糖，再以l-山梨糖为底物，通过伴生菌和产酸菌进一步生成2-kga。

3、原生质体融合技术是将亲缘关系较远的两个生物细胞融合在一起，融合后的细胞具有双亲特征性状，打破了传统有性生殖界限，成为遗传育种的重要手段。为了便于重组体的检出，用于原生质体融合的双亲需要携带不同的遗传标记，比如抗药性标记或营养缺陷标记等，现阶段常采用双亲灭活方法作为遗传标记，比如热灭活、紫外灭活、化学灭活等；由于灭活机制不同，根据“致死损伤互补”原理，灭活后的细胞通过融合再生，所得融合子兼具双亲性状且机能完整。

4、在1994年出版的《微生物学杂志》中，吕群燕等对地衣芽孢杆菌和2-kga产生菌的原生质体的制备条件进行了研究，并采用聚乙二醇作诱导剂进行两菌株的原生质体融合，用链霉素作为抗性标记对融合子进行选择，从融合子中选出了一株连续传代八次产酸高且产量稳定的融合子进行产酸；在该文献中，技术人员通过选用地衣芽孢杆菌作为伴生菌与产酸菌进行两菌株的原生质体融合进行产2-kga，虽然2-kga的产量比融合前的双亲本的混合菌系提高了约64％，但该文献中并未明确详细记载产量数据，且该体系是以l-山梨糖作为底物，属于三菌两步发酵生产体系的第二步，工艺流程较为复杂。

5、在1996年出版的《中国药科大学学报》中，盛勤等对经紫外线单亲灭活的软化芽孢杆菌原生质体和氧化葡萄糖酸杆菌原生质体在聚乙二醇诱导下进行融合，构建融合子后生产2-kga；其中需要进行说明的是，在二十世纪九十年代，国内维生素c的相关研究刚刚开始，此时对于普通生酮基古龙酸菌的认识不够完善，将其定义为了氧化葡萄糖酸杆菌，因此该文献实际上同样是将三菌两步发酵体系第二步中的伴生菌与产酸菌进行融合，工艺流程不够简便，另外在该项技术中通过研究发现融合子的产酸量低于亲本混合菌系，产酸能力较低。

6、综上，在现有的2-kga生产技术中，虽然公开了利用原生质体融合技术构建融合子进行产酸，但均是在以中间产物l-山梨糖作为底物的基础上进行的第二步发酵，工艺流程较为复杂，且产2-酮基-l-古龙酸效果不明显。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于原生质体融合技术生产2-酮基-l-古龙酸的方法，利用原生质体融合技术将维生素c生产中第一步发酵的氧化葡萄糖酸杆菌和第二步发酵的伴生菌巨大芽孢杆菌融合在一起，将得到的融合子与普通生酮基古龙酸菌混合发酵一步产酸，简化了工艺流程，且产酸效果明显提高。

2、本发明技术方案如下：

3、一种基于原生质体融合技术生产2-酮基-l-古龙酸的方法，将氧化葡萄糖酸杆菌和伴生菌利用原生质体融合技术构建融合子，然后将融合子与产酸菌混合进行发酵，得2-酮基-l-古龙酸。

4、优选的，所述伴生菌为巨大芽孢杆菌，所述产酸菌为普通生酮基古龙酸菌。

5、优选的，所述生产2-酮基-l-古龙酸的方法，具体包括如下步骤：

6、s1，两亲本菌体的制备：将氧化葡萄糖酸杆菌在山梨醇液体培养基中进行培养，将巨大芽孢杆菌lb液体培养基中进行培养，得到两亲本菌体；

7、s2，两亲本原生质体悬液的制备：用原生质体稳定液稀释所述s1中的两亲本菌体浓度至106～107个/ml，分别加入终浓度为1～3mg/ml的溶菌酶并进行酶解，将酶解后的菌体细胞洗涤、离心、重悬，分别得到氧化葡萄糖酸杆菌原生质体悬液和巨大芽孢杆菌原生质体悬液；

8、s3，两亲本原生质体的灭活：将所述s2中的原生质体悬液稀释至105～106个/ml后进行灭活，将灭活后的氧化葡萄糖酸杆菌原生质体悬液涂布于山梨醇再生培养基，将巨大芽孢杆菌原生质体悬液涂布于lb再生培养基，观察灭活情况；

9、s4，两亲本原生质体的融合：将所述s3中已经灭活的原生质体悬液等体积混合，然后加入混合液质量20～60％的聚乙二醇和终浓度为0.01～0.05mol/l的cacl2，于27～35℃下融合15～30min，得融合液；

10、s5，融合子的检出与筛选：将所述s4中的融合液涂布于山梨醇再生培养基中，培养2～3天，挑取长势良好的单菌落进行测序，同时具有两菌特征序列的菌株即为目的菌株；将检出的目的菌株与普通生酮基古龙酸菌配合进行混合发酵，筛选出2-kga产量较高的目的菌株，即为融合子；

11、s6，2-酮基-l-古龙酸的生产：将所述s5中筛选出来的融合子与普通生酮基古龙酸菌混合发酵，得2-酮基-l-古龙酸。

12、优选的，所述s2中的酶解条件为：温度30～40℃，转速180～220r/min，时间1～2h。

13、优选的，所述s3中的灭活方式为：巨大芽孢杆菌采用高温灭活，于60～90℃下灭活20～40min；氧化葡萄糖酸杆菌采用紫外灭活，将原生质体悬液距离紫外灯管10～30cm处照射1～15min。

14、优选的，所述s6中的发酵条件为：将融合子种子液和普通生酮基古龙酸菌种子液按菌液浓度比为4～6:1的比例接种于山梨醇发酵培养基，接种量为山梨醇发酵培养基体积的10％，于28～32℃条件下培养24h以上。

15、优选的，所述山梨醇液体培养基的组分包括：d-山梨醇5～15g/l，酵母粉3～8g/l，碳酸钙0.5～1.5g/l；所述lb液体培养基的组分包括：蛋白胨5～15g/l，酵母粉3～8g/l，氯化钠5～15g/l。

16、优选的，所述原生质体稳定液的组分包括：蔗糖160～180g/l，mgcl2·6h2o 3.5～4.5g/l，顺丁烯二酸2～2.5g/l。

17、优选的，所述山梨醇再生培养基的组分包括：d-山梨醇5～15g/l，酵母粉3～8g/l，蔗糖15～25g/l，碳酸钙0.5～1.5g/l，琼脂粉20g/l；所述lb再生培养基的组分包括：蛋白胨5～15g/l，酵母粉3～8g/l，蔗糖15～25g/l，氯化钠5～15g/l，琼脂粉20g/l。

18、优选的，所述山梨醇发酵培养基的组分包括：d-山梨醇75～85g/l，玉米浆粉5～15g/l，尿素5～15g/l，碳酸钙0.5～1.5g/l，kh2po4 0.5～1.5g/l，mgso4 0.1～0.5g/l。

19、本发明的有益效果：本发明首次将氧化葡萄糖酸杆菌和伴生菌利用原生质体融合技术构建融合子，然后将融合子与产酸菌混合进行一步发酵生产2-酮基-l-古龙酸，相比于传统的三菌一步发酵方法，本发明中2-kga的产量提高了约17.02％；相比于传统的三菌两步发酵方法，本发明不仅省去了二次灭菌和二次发酵的步骤，且在相同的2-kga产量下大大缩短了发酵周期，简化工艺流程的同时大大节约了生产成本，具有良好的工业前景。