无血清细胞培养体系及其细胞消化终止液的制作方法

本申请涉及细胞培养领域，尤其涉及无血清细胞培养体系及其细胞消化终止液。

背景技术：

1、目前，细胞的体外处理，包括收获后的运输和治疗制备，一般是在含有胎牛血清(fatal bovine serum，fbs)的培养基中进行的，它促进细胞的附着、增殖和分化。然而，由于fbs的使用存在安全问题，包括人畜共患病的潜在传播和移植排斥反应，因为fbs中的蛋白质和多肽被认为与培养的细胞结合，然后通过细胞移植过程转移到宿主，导致移植细胞的排斥反应因此临床处理细胞需要异种无血清培养基。

2、消除培养液中的血清和动物成分是确定细胞培养过程的重要一步。定义介质只包含具有已知化学特性的产品和材料，如小分子、盐和脂肪酸。这些培养基还可能包括动物系统中不产生的重组蛋白。加入无血清或无动物的培养基将在以下几个方面对细胞培养过程有好处：通过减少介质组成的可变性来提高一致性；简化对监管准则的遵从；如果原材料需要改变，简化可比性测试。

3、细胞脱离是培养贴壁细胞所必需的。胰蛋白酶化是最流行的分离技术，常规方式终止胰蛋白酶的消化作用是加入血清，然而在无血清的培养体系中，为了终止消化而引入血清，不符合临床要求。

技术实现思路

1、本申请的目的是，至少部分克服现有技术的不足，提供一种无血清的细胞消化终止液，并且利用该细胞消化终止液构建无血清细胞培养体系。

2、为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：

3、第一方面，提供一种细胞消化终止液，用于终止胰蛋白酶对体外贴壁培养细胞的消化进程，其包括以下组分：

4、转铁蛋白，终浓度为5-10mg/ml；

5、胰岛素，终浓度为1-5mg/ml；

6、维生素c，终浓度为5-10μm；

7、次黄嘌呤钠，终浓度为5-10mm；

8、胸苷，终浓度为1-3mm；

9、非必需氨基酸溶液，稀释至每种氨基酸终含量为0.1mm。

10、可选择地，所述细胞消化终止液需加入基础培养基中使用，所述基础培养基选自dmem/f12细胞培养基、f12细胞培养基和william's e细胞培养基中的一种。

11、可选择地，所述非必需氨基酸溶液为100倍浓缩液；所述非必需氨基酸溶液包含甘氨酸、l-丙氨酸、l天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸和l-丝氨酸。

12、优选地，所述细胞消化终止液不含血清。

13、进一步可选择地，所述细胞消化终止液适用于二维培养的细胞和三维培养的细胞。

14、可选择地，所述细胞消化终止液适用于体外培养的干细胞或肝细胞。

15、进一步地，所述细胞消化终止液适用于体外培养的人胚胎干细胞或肝癌细胞。

16、优选地，所述细胞消化终止液的工作温度为4℃。

17、进一步优选地，所述细胞消化终止液在胰蛋白酶消化细胞60min内加入以终止消化。

18、第二方面，提供一种无血清细胞培养体系，包括使用无血清细胞培养液和消化终止液，其特征在于，所述消化终止液采用如前所述的细胞消化终止液。

19、与现有技术相比较，本申请具有如下优势：

20、(1)本申请的细胞消化终止液，经验证具备竞争性结合胰蛋白酶作用，使细胞蛋白和胰蛋白酶结合的机会大大减少，从而起着终止胰蛋白酶消化细胞的效果，有效替血清终止消化的作用；

21、(2)本申请的细胞消化终止液与传统的含血清的终止液相比较，无明显的细胞毒性，在消化60min内加入对细胞活性的影响无明显差异；

22、(3)本申请的细胞消化终止液的组成成分清楚，都是容易获取、价格相对低廉的成分，不会大幅度提高本申请的的制备成本；

23、(4)本申请的细胞消化终止液，可以配合应用于多种基础培养基，可以适应不同细胞，为各种多类培养应用提供足够条件；不仅可以用于常规二维培养细胞，还可以用于在三维培养所形成的细胞球体，具有临床应用的良好前景。

技术特征：

1.一种细胞消化终止液，用于终止胰蛋白酶对体外贴壁培养细胞的消化进程，其特征在于，其包括以下组分：

2.如权利要求1所述的细胞消化终止液，其特征在于，所述细胞消化终止液需加入基础培养基中使用，所述基础培养基选自dmem/f12细胞培养基、f12细胞培养基和william's e细胞培养基中的一种。

3.如权利要求1所述的细胞消化终止液，其特征在于，所述非必需氨基酸溶液为100倍浓缩液；所述非必需氨基酸溶液包含甘氨酸、l-丙氨酸、l天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸和l-丝氨酸。

4.如权利要求1所述的细胞消化终止液，其特征在于，所述细胞消化终止液不含血清。

5.如权利要求1所述的细胞消化终止液，其特征在于，所述细胞消化终止液适用于二维培养的细胞和三维培养的细胞。

6.如权利要求1所述的细胞消化终止液，其特征在于，所述细胞消化终止液适用于体外培养的干细胞或肝细胞。

7.如权利要求6所述的细胞消化终止液，其特征在于，所述细胞消化终止液适用于体外培养的人胚胎干细胞或肝癌细胞。

8.如权利要求1所述的细胞消化终止液，其特征在于，所述细胞消化终止液的工作温度为4℃。

9.如权利要求1所述的细胞消化终止液，其特征在于，所述细胞消化终止液在胰蛋白酶消化细胞60min内加入以终止消化。

10.一种无血清细胞培养体系，包括使用无血清细胞培养液和消化终止液，其特征在于，所述消化终止液采用如权利要求1～9任意一项所述的细胞消化终止液。

技术总结
本申请公开一种细胞消化终止液，用于终止胰蛋白酶对体外贴壁培养细胞的消化进程，其包括以下组分：转铁蛋白，终浓度为5‑10mg/mL；胰岛素，终浓度为1‑5mg/mL；维生C，终浓度为5‑10μM；次黄嘌呤钠，终浓度为5‑10mM；胸苷，终浓度为1‑3mM；非必需氨基酸溶液，稀释至每种氨基酸终含量为0.1mM。本申请具备竞争性结合胰蛋白酶作用，使细胞蛋白和胰蛋白酶结合的机会大大减少，从而起着终止胰蛋白酶消化细胞的效果，有效替血清终止消化的作用，有利于在临床上应用，构建无血清细胞培养体系。

技术研发人员：高毅,黎少,欧楚澎,彭青,李阳
受保护的技术使用者：广东乾晖生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13