一种甲病毒减毒株的构建方法及应用

本发明属于甲病毒防治领域，尤其涉及一种甲病毒属病毒减毒株的构建及应用。

背景技术：

1、虫媒病毒(arbovirus)是指一些通过吸血的节肢动物如蚊虫、蜱等叮咬敏感的脊椎动物如鸟类、蝙蝠、灵长类和家畜等，而引起自然疫源性疾病及人兽共患病的一类病毒。虫媒病毒主要集中在披膜病毒科甲病毒属、黄病毒科黄病毒属、呼肠孤病毒科和布尼亚病毒科。甲病毒属病毒是最重要的蚊媒病毒之一，引起以发热、关节炎和脑炎为主要症状的疾病。自然情况下，蚊虫是甲病毒的传播媒介。近年来，在两栖类和爬行类动物中分离到了甲病毒，说明甲病毒的传播媒介和宿主在不断的增加。许多甲病毒将多种鸟类作为它们原始的脊椎动物贮存宿主，脊椎动物宿主感染甲病毒后大多不表现临床症状，其中一些脊椎动物感染后长期出现高滴度的病毒血症，这有利于感染叮咬它们的蚊，再通过蚊虫使病毒传播到其它脊椎动物，从而造成了病毒在蚊媒与脊椎动物之间的循环。甲病毒感染引起的临床表现比较复杂，该类疾病主要的临床表现为发烧、头痛、呕吐、嗜睡、抽搐和昏迷等一系列脑炎症状，还可在全身系统性疾病中表现为发烧，全身肌痛、关节痛和皮疹，严重者可侵犯内脏，如肝和肾，发生出血和休克，甚至会导致死亡。

2、盖塔病毒(getah virus,getv)是虫媒病毒中的一种，分类学上属于披膜病毒科(togaviridae)甲病毒属(alphavirus)成员。该病毒属还包括基孔肯雅病毒(chikv)、阿尼昂尼昂病毒(onnv)、马亚罗病毒(mayv)、罗斯河病毒(rrv)、东部马脑炎病毒(eeev)、西部马脑炎病毒(weev)、委内瑞拉马脑炎病毒(veev)、辛德比斯病毒(sindbis virus)、特罗卡拉病毒(trocara virus)等，这些都是在人类中引起严重临床症状甚至致命的传染病。getv分布广泛，可引起猪、马、牛、狐狸等多种家畜和野生动物感染，人也可以感染。近年来，getv在猪群中爆发，导致部分猪场经济损失严重，已成为畜牧业的一个潜在威胁。另外，getv具有成为人畜共患病的潜在风险，应该为getv向人类的传播做好计划和准备。

3、getv为单股正链rna病毒，全长约12knt，基因组中含有两个开放阅读框(orf)。病毒基因组的长度在11000-12000核苷酸之间，具有5’帽子结构和3'poly(a)尾，5’端非编码区和3'端非编码区分别为约为78个nt和411个nt,非编码区之间包含2个独立的开放阅读框，分别编码病毒的结构蛋白和非结构蛋白。其中，5'端的orf是通过帽依赖性翻译起始机制从病毒基因组的5'端起始非结构蛋白的翻译，而3'端的orf则是利用病毒复制过程中的亚基因组rna以帽依赖型翻译起始机制起始结构蛋白的翻译。非结构蛋白和结构蛋白编码区之间有44个nt组成的连接区，连接区可形成亚基因组启动子。

4、传统的减毒活疫苗毒株是通过强毒株在细胞培养物或异体上连续传代产生的，这种减毒通常依赖于有限数量的点突变，存在影响疫苗的免疫原性或毒力返强风险。例如，chikv 181/25减毒株虽然在啮齿动物和非人类灵长动物中表现出减毒和高免疫原性，但在ii期临床试验中，59名参与者中有5人产生了轻度、短暂的关节痛(edelman et al.,2000)，并且从接种者血液中分离的病毒显示其减毒位点发生了回复突变(gorchakov et al.,2012)。近年来，利用反向遗传操作技术通过不同种甲病毒之间的嵌合来致弱病毒。这种病毒在自然界中经媒介传播，可能会以不可预见和意想不到的方式进化，存在安全性问题。1971年德克萨斯州为控制疫情使用了veev tc-83减毒活疫苗，然而，在路易斯安那州蚊子中分离出来该疫苗株，表明甲病毒减毒疫苗株存在蚊子媒介传播的风险(pedersen etal.,1972)。另外，sinv/veev嵌合疫苗株的感染试验也证明其可以通过蚊子媒介进行传播(arrigo et al.,2008)。然而，针对该病尚无有效的抗病毒药物和商业化疫苗。由于该病毒免疫原性差，制备灭活疫苗免疫保护期较短。与灭活疫苗相比，减毒活疫苗可以刺激机体产生强大的特异性体液免疫反应和细胞免疫反应，具有免疫效果好，保护持续期长等优点。因此，开发安全有效的getv减毒活疫苗对于getv的防控具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明首次在甲病毒的基因组中通过突变失活亚基因组启动子并引入微rna病毒ires翻译起始元件阻断甲病毒在蚊虫中的复制，从而切断病毒的传播途径增加疫苗的安全性，同时通过改变病毒的翻译起始机制达到致弱病毒目的，所获得的减毒株不但减毒效果理想、可诱导保护性免疫反应，而且所获得的毒株不能在动物-动物、动物-蚊虫间传播，安全性好，在此基础上完成了本发明。

2、第一方面，本发明提供一种重组甲病毒属病毒，所述重组病毒是在甲病毒的基因组中通过突变方法失活其亚基因组启动子并引入微rna病毒ires翻译起始元件获得重组甲病毒属病毒。

3、进一步的，所述的甲病毒属病毒包括但不限于基孔肯雅病毒、阿尼昂尼昂病毒、马亚罗病毒、罗斯河病毒、东部马脑炎病毒、西部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、辛德比斯病毒、特罗卡拉病毒、盖塔病毒中的一种或多种。

4、进一步的，所述的甲病毒属病毒选自辛德比斯病毒和盖塔病毒。

5、进一步的，所述的甲病毒属的重组病毒优选盖塔病毒。

6、进一步的，所述的微rna病毒包括但不限于口蹄疫病毒、脑心肌炎病毒、小鼠腦脊髓炎病毒、脊髓灰质炎病毒、肠道病毒中的一种或多种。

7、进一步的，所述的微rna病毒优选口蹄疫病毒。

8、进一步的，所述的ires元件选自i型ires元件、ii型ires元件、iii型ires元件、iv型ires元件、v型ires元件中的一种或多种。

9、进一步的，所述的ires元件优选ii型ires元件。

10、进一步的，所述的启动子为甲病毒亚基因组启动子。

11、第二方面，本发明提供一种包含本发明第一方面的重组甲病毒属病毒的组合物，所述的重组甲病毒属病毒是在甲病毒的基因组中通过突变方法失活其亚基因组启动子并引入微rna病毒ires翻译起始元件获得重组甲病毒属病毒。

12、进一步，所述组合物还可以包含佐剂和/或药学上可接受的辅料。

13、进一步，所述组合物还可以包含其它不同于重组甲病毒属病毒的抗原成分。

14、进一步，所述组合物可以制备为疫苗、检测试剂或其他生物诊断试剂。

15、第三方面，本发明提供一种本发明第一方面的重组甲病毒属病毒在制备疫苗中的用途。

16、进一步的，所述疫苗给药途径选自：经口给药、舌下给药、胃或肠给药、局部给药、注射给药、静脉注射、皮下注射、肌肉注射。

17、进一步的，所述疫苗用于人、猪、马、牛、狐狸等多种家畜和野生动物。

18、第四方面，本发明提供一种本发明第一方面的重组甲病毒属病毒株的构建方法，所述方法包括如下步骤：

19、s1.构建甲病毒属病毒的全长cdna感染性克隆；

20、s2.在甲病毒全长cdna感染性克隆中通过突变方法失活甲病毒亚基因组启动子并引入微rna病毒ires翻译起始元件，构建重组质粒；

21、s3.将构建的重组质粒转染至宿主细胞，获得重组甲病毒属病毒株。

22、进一步的，所述的ires元件可为i型ires元件、ii型ires元件、iii型ires元件、iv型ires元件、v型ires元件中的一种或多种。

23、进一步的，所述的ires元件优选ii型ires元件。

24、进一步的，所述的甲病毒启动子为亚基因组启动子。

25、本发明构建的虫媒病毒甲病毒属的重组病毒株，毒性致弱，减毒效果理想、可诱导机体产生保护性免疫反应，而且该毒株不能在动物-动物、动物-蚊虫间传播，安全性好。