细胞快速化学重编程技术

本发明涉及诱导多能干细胞领域。具体地，涉及一种细胞快速化学重编程技术。

背景技术：

1、小分子可用于促进体细胞重编程为诱导多能干细胞(ipsc)。2013年，完全使用小分子实现将体细胞重编程为诱导多能干细胞(ipsc)的技术最早被邓宏魁课题组报道，使用到的小分子名称为vpa、chir99021、repsox、forskolin、tranylcypromine和dznep。这一技术被称为化学重编程。最早的化学重编程技术需要约60天实现这个过程(hou p.p.,etal.,pluripotent stem cells induced from mouse somatic cells by small-moleculecompounds.science,2013.341(6146):p.651-54.)。之后，对这一技术改进的主要进步分别有三个报道。其一，2015年，邓宏魁课题组将am580、epz004777、sgc0946和5-aza-dc这4个小分子加入到这一重编程体系中，将化学重编程过程缩短到约40天(zhao y.,et al.,a xen-like state bridges somatic cells to pluripotency during chemicalreprogramming.cell,2015.163(7):p.1678-91.)；其二，2018年，裴端卿课题组独立建立了一个化学重编程体系，同样需要约40天实现这一过程，相较邓宏魁课题组2015年的报道效率更高(cao s.,et al.,chromatin accessibility dynamics during chemicalinduction of pluripotency.cell stem cell,2018.22(4):p.529-42e5.)；其三，2018年，邓宏魁课题组进一步优化2015年的化学重编程体系，并将时间缩短到约20天，但是形成诱导多能干细胞效率偏低(zhao t.,et al.,single-cell rna-seq reveals dynamic earlyembryonic-like programs during chemical reprogramming.cell stem cell,2018.23(1):p.31-+.)。在2018年之后，本领域未见更快速高效技术的报道。

2、现有技术中，需要较长时间才能完成整个化学重编程过程。效率较高的技术需要约40天完成。20天左右可以完成化学重编程的技术效率偏低，例如每50000个初始细胞仅能形成约20-30个诱导多能干细胞克隆。

3、因此，本领域需要提供一种高效、快速的细胞化学重编程技术。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种细胞快速化学重编程技术。

2、在本发明的第一方面，提供了一种化学重编程促进剂，所述化学重编程促进剂选自下组a：

3、(a1)sr11237；

4、(a2)cd3254；

5、(a3)cct129202；

6、(a4)r406；

7、(a5)dmh1；

8、(a6)bml-277；

9、(a7)azd9291 mesylate；

10、(a8)tsa；

11、(a9)sgc-cbp30

12、(a10)citarinostat；

13、(a11)tmp269；

14、(a12)ws6；

15、(a13)(a1)～(a12)的任意组合。

16、在另一优选例中，所述化学重编程促进剂为选自下组的化合物：

17、(1)sr11237，cd3254；

18、(2)cct129202，r406；

19、(3)dmh1，bml-277，azd9291 mesylate，tsa，sgc-cbp30，citarinostat；

20、(4)dmh1，bml-277，azd9291 mesylate，tsa，tmp269；和

21、(5)ws6。

22、在另一优选例中，在重编程培养基中，所述化学重编程促进剂具有选自下组的浓度：

23、sr11237：0.05-0.5μm；

24、cd3254：0.05-0.5μm；

25、cct129202：0.2-2μm；

26、r406：0.5-2μm；

27、dmh1：0.1-5μm；

28、bml-277：5-20μm；

29、azd9291 mesylate：1-5μm；

30、tsa：5-20nm；

31、sgc-cbp30：0.5-5μm；

32、citarinostat：1-3μm；

33、tmp269：1-10μm；

34、ws6：0.1-2μm。

35、在本发明的第二方面，提供了一种化学重编程促进剂的用途，用于制备使成纤维细胞向诱导多能干细胞转化的试剂或试剂盒；其中，所述的化学重编程促进剂选自下组：

36、(a1)sr11237；

37、(a2)cd3254；

38、(a3)cct129202；

39、(a4)r406；

40、(a5)dmh1；

41、(a6)bml-277；

42、(a7)azd9291 mesylate；

43、(a8)tsa；

44、(a9)sgc-cbp30

45、(a10)citarinostat；

46、(a11)tmp269；

47、(a12)ws6；

48、(a13)(a1)～(a12)的任意组合。

49、在另一优选例中，所述成纤维细胞为哺乳动物成纤维细胞；较佳地为小鼠、大鼠、兔子、猴、人的成纤维细胞。

50、在另一优选例中，所述成纤维细胞为小鼠成纤维细胞，较佳地为小鼠背部成纤维细胞(mdf)、小鼠肺成纤维细胞(mlf)、小鼠肝脏成纤维细胞、小鼠心脏成纤维细胞或小鼠胚胎成纤维细胞(mef)。

51、在本发明的第三方面，提供了一种用于化学重编程的培养基，包含基础培养成分和化学重编程促进剂，所述的化学重编程促进剂选自下组a：

52、(a1)sr11237；

53、(a2)cd3254；

54、(a3)cct129202；

55、(a4)r406；

56、(a5)dmh1；

57、(a6)bml-277；

58、(a7)azd9291 mesylate；

59、(a8)tsa；

60、(a9)sgc-cbp30

61、(a10)citarinostat；

62、(a11)tmp269；

63、(a12)ws6；

64、(a13)(a1)～(a12)的任意组合。

65、在另一优选例中，所述基础培养成分包括基础培养基、血清或血清替代物、非必须氨基酸溶液、青霉素/链霉素混合液、1×n2添加剂，1×b27添加剂、谷氨酰胺替代物溶液或vc。

66、在另一优选例中，所述基础培养基选自下组：dmem basic培养基、neurobasal培养基、或dmem/f12培养基。

67、在另一优选例中，所述用于化学重编程的培养基还包括其他的生长因子和化合物，包括但不限于：β-巯基乙醇、碱性成纤维细胞生长因子、chir99021、616452、forskolin、am580、epz004777、vpa、5-aza-dc、sgc0946、小鼠白血病抑制因子、pd0325901。

68、在本发明的第四方面，提供了一种将成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞的方法，包括：

69、(s1)提供一成纤维细胞；

70、(s2)利用第一重编程细胞培养基，预培养(s1)中的成纤维细胞，获得第一中间态细胞；

71、(s3)利用第二重编程细胞培养基，培养上述的第一中间态细胞，获得第二中间态细胞；

72、(s4)利用第三重编程细胞培养基，培养上述的第二中间态细胞，获得第三中间态细胞；

73、(s5)利用第四重编程细胞培养基，培养上述的第三中间态细胞，获得第四中间态细胞；和

74、(s6)扩增上述第四中间态细胞，获得诱导多能干细胞。

75、在另一优选例中，(s1)中，所述成纤维细胞的密度为104-106个细胞/孔。

76、在另一优选例中，(s2)中，所述第一重编程细胞培养基包含选自下组的化合物：sr11237，cd3254。

77、在另一优选例中，(s2)中，所述第一重编程细胞培养基还包含选自下组的化合物：碱性成纤维细胞生长因子，chir99021，616452，forskolin，am580，epz004777。

78、在另一优选例中，(s2)中，所述sr11237的浓度为0.05-0.5μm；

79、在另一优选例中，(s2)中，所述cd3254的浓度为0.05-0.5μm。

80、在另一优选例中，(s2)中，培养时间为t1，t1为0-3天；较佳地为0.5-2天。

81、在另一优选例中，(s3)中，所述第二重编程细胞培养基包含选自下组的化合物：cct129202，r406。

82、在另一优选例中，(s3)中，所述第二重编程细胞培养基还包含选自下组的化合物：碱性成纤维细胞生长因子，chir99021，616452，forskolin，am580，sr11237，cd3254，vpa。

83、在另一优选例中，(s3)中，所述cct129202的浓度为0.2-2μm。

84、在另一优选例中，(s3)中，所述r406的浓度为0.5-2μm。

85、在另一优选例中，(s3)中，培养时间为t2，t2为0-3天；较佳地为0.5-2天。

86、在另一优选例中，(s4)中，所述第三重编程细胞培养基包含选自下组的化合物：dmh1、bml-277、azd9291 mesylate、tsa、sgc-cbp30，citarinostat。

87、在另一优选例中，(s4)中，所述第三重编程细胞培养基还包含选自下组的化合物：碱性成纤维细胞生长因子，chir99021，616452，5-aza-dc，sgc0946。

88、在另一优选例中，(s4)中，所述dmh1的浓度为0.1-5μm；

89、bml-277的浓度为5-20μm；

90、azd9291 mesylate的浓度为1-5μm；

91、tsa的浓度为5-20nm；

92、sgc-cbp30的浓度为1-10μm；

93、citarinostat的浓度为1-3μm。

94、在另一优选例中，(s4)中，培养时间为t3，t3为0-3天；较佳地为0.5-2天。

95、在另一优选例中，(s5)中，所述第四重编程细胞培养基包含选自下组的化合物：dmh1、bml-277、azd9291 mesylate、tsa、tmp269。

96、在另一优选例中，(s5)中，所述第四重编程细胞培养基还包含选自下组的化合物：碱性成纤维细胞生长因子，小鼠白血病抑制因子，chir99021，616452，5-aza-dc。

97、在另一优选例中，(s5)中，所述dmh1的浓度为0.1-5μm；

98、bml-277的浓度为5-20μm；

99、azd9291 mesylate的浓度为1-5μm；

100、tsa的浓度为5-20nm；

101、tmp269的浓度为1-10μm。

102、在另一优选例中，(s5)中，培养时间为t3，t3为0-3天；较佳地为0.5-2天。

103、在另一优选例中，从(s1)的成纤维细胞培养获得(s5)的第四中间态细胞的培养时间为5-10天，较佳地6-8天。

104、在另一优选例中，(s6)中，包括：

105、利用第五重编程细胞培养基培养第四中间态细胞，获得第五中间态细胞。

106、在另一优选例中，所述第五重编程细胞培养基包含ws6。

107、在另一优选例中，(s6)中，还包括：利用第六重编程细胞培养基培养第五中间态细胞，获得诱导多能干细胞。

108、在另一优选例中，所述第六重编程细胞培养基包含ws6。

109、在另一优选例中，(s6)中，所述第五重编程细胞培养基还包含选自下组的化合物：小鼠白血病抑制因子，chir99021，616452，vc，pd0325901。

110、在另一优选例中，所述第六重编程细胞培养基还包含选自下组的化合物：小鼠白血病抑制因子，chir99021，vc，pd0325901。

111、在另一优选例中，(s6)中，所述ws6的浓度为0.1-2μm。

112、在另一优选例中，(s6)中，培养时间为t4，t4为0-6天，较佳地0.5-4天。

113、在另一优选例中，所述成纤维细胞为哺乳动物成纤维细胞；较佳地为小鼠、大鼠、兔子、猴、人的成纤维细胞。

114、在另一优选例中，所述成纤维细胞为小鼠成纤维细胞，较佳地为小鼠背部成纤维细胞(mdf)、小鼠肺成纤维细胞(mlf)、小鼠肝脏成纤维细胞、小鼠心脏成纤维细胞或小鼠胚胎成纤维细胞(mef)。

115、在本发明的第五方面，提供了一种用本发明的第四方面的方法制备获得的胚胎干细胞，所述细胞表达以下的标志物：oct4、sox2、rex1、nanog。

116、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。