嵌合抗原受体及其应用的制作方法

本发明涉及生物制药领域，具体地，本发明涉及一种嵌合抗原受体及其应用，具体地，本发明涉及一种能识别nkg2d多种配体的嵌合抗原受体及对应核酸分子、表达载体、慢病毒载体、转基因免疫细胞、药物组合物及其用途。

背景技术：

1、近年来，嵌合抗原受体t(chimeric antigen receptor t，car-t)细胞在血液恶性肿瘤治疗中取得了巨大的成就。但是car-t细胞在临床应用中仍存在一系列挑战，例如，在实体瘤的治疗中显示出很低的疗效；肿瘤通过丢失抗原的免疫逃逸机制使得car-t细胞治疗出现脱靶效应和耐药。car-t细胞需要自体过继细胞移植，否则异基因t细胞可能导致移植物抗宿主病(gvhd)；易产生细胞因子风暴、神经毒性等不良反应，对患者的生命造成危害。最新的研究表明，car-nk细胞可能会克服car-t细胞的上述缺陷，并显示出显著的抗肿瘤作用。

2、car-nk细胞体内应用一般不会引起细胞因子风暴，nk细胞不需要严格的hla匹配，没有引起gvhd的潜力；nk细胞不需要抗原递呈、不受mhc限制，即可发挥直接的杀伤肿瘤细胞的作用；car-nk细胞不仅可以通过安装的“car”精准识别肿瘤，而且还可通过其本身表达的活化受体识别肿瘤细胞相应配体激活活化信号，以car非依赖的方式杀伤肿瘤，抗瘤谱广，且可防止肿瘤通过抗原或mhc分子丢失而发生脱靶效应和免疫逃逸。car-nk细胞还可以与抗体联用，通过其表面的fcγrⅲ(cd16)与抗体的fc段结合，借助抗体依赖的细胞毒活性(adcc)从而放大car-nk细胞的抗肿瘤疗效。因此，car-nk细胞在抗肿瘤治疗中具有广泛的应用前景，已成为细胞免疫治疗研发领域的热点。

3、传统的car-t或car-nk技术多通过表达特异性识别特定肿瘤抗原的单链抗体(scfv)靶向识别肿瘤，启动胞内段的活化信号，介导对肿瘤细胞的杀伤。但是传统scfv识别肿瘤单一抗原，在肿瘤抗原丢失时可能发生脱靶效应和治疗性耐药或复发，限制了car-t或car-nk技术的进一步应用。

4、实体肿瘤内复杂的免疫抑制微环境也是严重影响car-t或car-nk细胞发挥抗肿瘤作用的限制因素之一。骨髓来源的抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,mdscs)是一群由骨髓来源的抑制性细胞，能抑制机体免疫细胞的抗肿瘤效应。有研究表明，mdscs通过膜结合tgf-β使nkg2d的表达下调，从而抑制nk细胞的功能。mdscs还可以诱导treg细胞扩增，促进其对免疫的负调作用。此外，mdscs通过产生活性氧等方式来抑制t细胞免疫应答与增殖。因此，如何克服肿瘤微环境内mdscs对免疫细胞，尤其是回输治疗的car-t或car-nk细胞的免疫抑制，已成为突破实体瘤免疫治疗瓶颈的研发热点。

5、因此，仍需要开发新的免疫细胞修饰技术，以进一步提高car-t或car-nk的治疗效果。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种嵌合抗原受体，本发明的嵌合抗原受体能识别nkg2d多种配体，经其修饰的免疫细胞不仅可以靶向识别并杀伤多种表达nkg2d配体的肿瘤，还可以对mdscs具有显著提高的杀伤效率，进而消除mdscs对免疫细胞的负面调节作用，逆转肿瘤免疫抑制微环境，确保免疫细胞在生物体内能够更有效地发挥抗肿瘤作用。本发明的嵌合抗原受体可用于开发通用型的免疫细胞产品，实现一种car-t或car-nk产品对多种肿瘤适应症的治疗，临床应用前景好。

2、需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：

3、nk细胞受体具有广泛特异性识别的特点，其活化受体识别的配体表达于绝大多数血液系统肿瘤和实体肿瘤，而在正常细胞几乎不表达。因此，选用nk细胞受体作为嵌合抗原受体的抗原结合域，并进一步通过该嵌合抗原受体基因修饰免疫细胞，得到的免疫细胞可能具有更广泛的肿瘤识别谱。

4、为了获得性能改良的car-免疫细胞，发明人创造性的选择了nkg2d的全长序列和dap10的全长序列，构建可广泛结合nkg2d多种配体的嵌合抗原受体结构；同时，巧妙地将dap10分子的胞内段作为嵌合抗原受体胞内区激活序列，发挥共刺激结构域功效。基于此，发明人获得了一种可广泛识别nkg2d配体的嵌合抗原受体。

5、进一步的试验结果表明：经本发明的嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞(例如nk细胞)，能够识别nkg2d的多种配体，靶向识别并杀伤多种表达nkg2d配体的血液瘤和实体瘤细胞，具有通用型car-免疫细胞产品的特点。

6、mdscs与免疫细胞(如t细胞、nk细胞、树突细胞、巨噬细胞等)相互作用并抑制机体的免疫应答。在肝癌小鼠中，mdscs细胞能够抑制nk细胞表面受体nkg2d的表达和ifn-γ的产量，诱导nk细胞失能。发明人意外发现，经本发明的嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞(例如nk细胞)不仅可靶向杀伤nkg2d配体阳性的肿瘤细胞，还能够有效杀伤mdscs。在含有mdscs的人肝癌h7402细胞荷瘤小鼠模型中，尾静脉回输免疫细胞或经本发明的嵌合抗原受体免疫细胞进行治疗，结果显示：本发明的嵌合抗原受体免疫细胞通过有效清除肿瘤微环境中对免疫效应细胞发挥抑制作用的负面调节mdscs细胞，从而挽救处于肿瘤微环境的免疫细胞免受mdscs的抑制，使免疫细胞(包括本发明的免疫细胞和未经基因修饰的免疫细胞)能够更有效地发挥抗肿瘤作用，进而提高免疫细胞产品的临床疗效。

7、因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种嵌合抗原受体。所述嵌合抗原受体包括：第一片段，所述第一片段为nkg2d全长序列；第二片段，所述第一片段为dap10全长序列，所述第一片段和所述第二片段相连；胞内信号转导结构域，所述胞内信号转导结构域的n端与所述第一片段或第二片段的c端相连。本发明的嵌合抗原受体具有更强、更广泛的nkg2d配体结合活性，表达本发明的嵌合抗原受体的免疫细胞，可有效靶向识别并杀伤多种表达nkg2d配体的血液瘤和实体瘤细胞，具有通用型car-免疫细胞产品的特点。

8、在本发明的第二方面，本发明提出了一种核酸分子。所述核酸分子包括第一核酸分子，所述第一核酸分子编码本发明第一方面的嵌合抗原受体。携带上述核酸分子的免疫细胞表达本发明第一方面的嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体可进一步识别并结合nkg2d的多种配体，由此，实现所述免疫细胞对多种表达nkg2d配体的血液瘤和实体瘤细胞的靶向识别，并进一步发挥其杀伤活性。

9、在本发明的第三方面，本发明提出了一种表达载体。所述表达载体携带本发明第二方面的核酸分子。由此，利用构建得到的表达载体表达在细胞内，有效表达并获得本发明第一方面的嵌合抗原受体。

10、在本发明的第四方面，本发明提出了一种转基因免疫细胞。所述转基因免疫细胞表达本发明第一方面的嵌合抗原受体，或携带本发明第二方面的核酸分子或本发明第三方面的表达载体。由此获得本发明转基因免疫细胞，其不仅可广泛靶向识别并杀伤多种表达nkg2d配体的实体瘤或血液瘤，而且可以有效杀伤肿瘤微环境中的免疫抑制性细胞mdscs，是一种通用型的免疫细胞产品，临床疗效良好，能用于多种肿瘤疾病的治疗，具有良好的临床应用前景。

11、在本发明的第五方面，本发明提出了一种药物组合物。所述药物组合物包括本发明第一方面的嵌合抗原受体、本发明第二方面的核酸分子、本发明第三方面的表达载体或本发明第四方面的转基因免疫细胞。由此，获得的药物组合物可进一步用于多种肿瘤疾病的预防或治疗。

12、在本发明的第六方面，本发明提出了一种制备制药的用途。本发明第一方面的嵌合抗原受体、本发明第二方面的核酸分子、本发明第三方面的表达载体、本发明第四方面的转基因免疫细胞或本发明第五方面的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗肿瘤。利用本发明的嵌合抗原受体及对应的核酸分子、表达载体、转基因免疫细胞或药物组合物可进一步制备成药物，该药物在临床上可用于预防或治疗疾病。

13、本领域技术人员能够理解的是，前面针对嵌合抗原受体、核酸分子、表达载体、慢病毒载体、转基因免疫细胞和药物组合物所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。

14、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。