一种提高慢病毒稳定性的PEG修饰方法与流程

本发明涉及生物制剂保存，具体地说，涉及一种提高慢病毒稳定性的peg修饰方法。

背景技术：

1、car-t疗法，也称为嵌合抗原受体t细胞免疫疗法，其通过优化改良在临床肿瘤治疗上取得很好的效果，是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗方法；

2、技术人员通过基因工程技术，使用慢病毒，感染t细胞，装上定位导航装置car(肿瘤嵌合抗原受体)，即car-t细胞，可以特异性识别体内肿瘤细胞，并通过免疫作用释放大量的多种效应因子，高效地杀灭肿瘤细胞，从而达到治疗恶性肿瘤的目的；

3、慢病毒的生产和制备，是改造t细胞很重要的一环，如何生产、有效保存并发挥其独特的感染改造t细胞的特性，值得研究，慢病毒整体大小约100nm，在病毒载体中属于体积较大类型，属于逆转录病毒科的一种，但其结构和基因组的复杂程度远超其他逆转录病毒，在日常生产中，慢病毒体积较大，容易受到剪切力的影响而导致结构受到破坏，还有蛋白之间相互黏连、降解等因素，同时考虑到37℃条件下慢病毒的半衰期只有6-12h，工业化慢病毒生产，收集慢病毒上清、柱层析纯化回收、浓缩换液、制剂分装过程长达2-4天，制剂冻融过程也会造成慢病毒活性降低，病毒降解速率过快导致t细胞感染时效果不佳，因此在生产中，如何提高慢病毒的稳定性以及延长其半衰期是重要课题。

4、聚乙二醇修饰即peg化，是将活化的peg通过化学方法以共价键偶联到蛋白质或多肽分子表面，自davis1977年首次用peg修饰牛血清白蛋白以来，peg修饰技术广泛应用于多种蛋白质和多肽的化学修饰，它可以使蛋白半衰期延长、免疫原性降低或消失、毒副作用减少以及物理、化学和生物稳定性增强等，聚乙二醇具有免疫学惰性，即使分子量高达5.9×106da，本身的免疫原性也很低，临床上使用聚乙二醇修饰蛋白治疗未发现抗聚乙二醇抗体产生，然而peg修饰蛋白质主要通过peg末端羟基与蛋白质氨基酸残基反应实现，而peg末端羟基活性很差，必须使用活化剂对其进行活化，才能在体内温和的条件下对蛋白质进行共价修饰。

5、为了提高慢病毒的稳定性以防止其降解，提出一种提高慢病毒稳定性的peg修饰方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种提高慢病毒稳定性的peg修饰方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明目的在于，提供了一种提高慢病毒稳定性的peg修饰方法，包括以下步骤：

3、s1、培养悬浮293f细胞并转染制备dna和pei相混合的混合液；

4、s2、配制a、b液，涡旋混匀后室温静止后，将a液加入到b液中吹打混匀，室温静置形成培养液；

5、s3、将混合液加入到培养液中进行灌流培养后深层过滤去除细胞及碎片，收集细胞上清液；

6、s4、细胞上清液加入mpeg-马来酰亚胺正己酸酯，继续摇动反应后，浓缩慢病毒上清液；

7、s5、通过低压层析柱纯化回收慢病毒，得到慢病毒制剂并分装保存。

8、作为本技术方案的进一步改进，所述s1中，通过培养基和细胞波浪反应器培养悬浮293f细胞，并在37℃，8％co2，角度为7°时以30rpm/min的频率摇动。

9、作为本技术方案的进一步改进，所述s1中，转染前一天按照2.0×106cells/ml密度接种，并且转染时采用瞬时转染工艺。

10、作为本技术方案的进一步改进，所述s2中，a液为3mg质粒+60ml培养基，b液为12mgpei+60ml培养基。

11、作为本技术方案的进一步改进，所述s3中，灌流培养时速率为1ml/min，培养至65h后进行深层过滤。

12、作为本技术方案的进一步改进，所述s3中，深层过滤去除细胞及碎片时的速率为15ml/min，且压力小于1ba，收集细胞上清液后在4℃环境中放置保存。

13、作为本技术方案的进一步改进，所述s4中，细胞上清液以1.5g/l的比例加入mpeg-马来酰亚胺正己酸酯。

14、作为本技术方案的进一步改进，所述s4中，使用中空纤维柱浓缩慢病毒上清液，且浓缩时流速为35ml/min，跨膜压差为0.5ba。

15、作为本技术方案的进一步改进，所述s5中，低压层析柱为26/100网络预填充管柱。

16、作为本技术方案的进一步改进，所述s5中，分装时以500ul/管进行分装，且分装后在-80℃环境中进行保存。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果：

18、该提高慢病毒稳定性的peg修饰方法中，经过mpeg修饰的慢病毒，有效降低了病毒降解，可以在t细胞上清中存在更久，提高了感染效率，并且其在溶液中无论是处于游离还是结合形式，不仅对慢病毒没有副作用，还可以增加其水溶性外，减少免疫原性，提高慢病毒的稳定性，延长慢病毒的半衰期。

技术特征：

1.一种提高慢病毒稳定性的peg修饰方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的提高慢病毒稳定性的peg修饰方法，其特征在于：所述s1中，通过培养基和细胞波浪反应器培养悬浮293f细胞，并在37℃，8％co2，角度为7°时以30rpm/min的频率摇动。

3.根据权利要求1所述的提高慢病毒稳定性的peg修饰方法，其特征在于：所述s1中，转染前一天按照2.0×106cells/ml密度接种，并且转染时采用瞬时转染工艺。

4.根据权利要求1所述的提高慢病毒稳定性的peg修饰方法，其特征在于：所述s2中，a液为3mg质粒+60ml培养基，b液为12mg pei+60ml培养基。

5.根据权利要求1所述的提高慢病毒稳定性的peg修饰方法，其特征在于：所述s3中，灌流培养时速率为1ml/min，培养至65h后进行深层过滤。

6.根据权利要求1所述的提高慢病毒稳定性的peg修饰方法，其特征在于：所述s3中，深层过滤去除细胞及碎片时的速率为15ml/min，且压力小于1ba，收集细胞上清液后在4℃环境中放置保存。

7.根据权利要求1所述的提高慢病毒稳定性的peg修饰方法，其特征在于：所述s4中，细胞上清液以1.5g/l的比例加入mpeg-马来酰亚胺正己酸酯。

8.根据权利要求1所述的提高慢病毒稳定性的peg修饰方法，其特征在于：所述s4中，使用中空纤维柱浓缩慢病毒上清液，且浓缩时流速为35ml/min，跨膜压差为0.5ba。

9.根据权利要求1所述的提高慢病毒稳定性的peg修饰方法，其特征在于：所述s5中，低压层析柱为26/100网络预填充管柱。

10.根据权利要求1所述的提高慢病毒稳定性的peg修饰方法，其特征在于：所述s5中，分装时以500ul/管进行分装，且分装后在-80℃环境中进行保存。

技术总结
本发明涉及生物制剂保存技术领域，具体地说，涉及一种提高慢病毒稳定性的PEG修饰方法。其包括以下步骤：培养并转染制备混合液；配制A、B液形成培养液；将混合液加入到培养液中进行灌流培养，深层过滤去除细胞及碎片，收集细胞上清液；细胞上清液加入mPEG‑马来酰亚胺正己酸酯，继续摇动反应后，浓缩慢病毒上清液；通过低压层析柱纯化回收慢病毒，得到慢病毒制剂并分装保存。本发明中经过mPEG的修饰慢病毒，有效降低了病毒降解，可以在T细胞上清中存在更久，提高了感染效率，并且其在溶液中无论是处于游离还是结合形式，不仅对慢病毒没有副作用，还可以增加其水溶性外，减少免疫原性，提高慢病毒的稳定性，延长慢病毒的半衰期。

技术研发人员：唐东起,王道光,吴雨菲,马鑫鑫,辛家伟,田玲
受保护的技术使用者：山东大华凯特生物集团有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15