一种检测猪呼吸道病原的多重PCR引物组及其应用

本发明属于病原检测领域，具体涉及一种检测猪呼吸道病原的多重pcr引物组，本发明还涉及该引物组在制备猪呼吸道病原检测试剂盒中的应用，以及一种非诊断目的检测猪呼吸道病原的方法。

背景技术：

1、猪呼吸道疾病一直是困扰我国养猪业的一大难题，猪患病后生长速度和饲料利用率降低、食欲减退，虽然总体死亡率不高，但可严重影响猪场的经济效益。猪呼吸道疾病病因复杂，临床上多是由于混合感染，链球菌(ss)，大肠杆菌(e.coli)、胸膜肺炎放线杆菌(app)，巴氏杆菌(pm)，副猪嗜血杆菌(hps)是目前猪群中主要流行的导致猪呼吸道疾病的传染病原。目前临床上对这些病原的检测主要是细菌分离鉴定和分子生物学方法，细菌分离鉴定耗费时间过长，分子生物学方法检测周期短，准确性高，尤其是多重pcr能在同一个反应体系中实现对多个目的片段的扩增，可同时检测多种病原菌，大大节约了检测成本和周期。但是现有的pcr方法都是对其中的一个或几个病原菌进行检测，且目前很多检测是针对16srdna设计引物，虽然16srdna高度保守但是不同细菌的16srdna同源性较高，容易出现假阳性。

2、链球菌的毒力因子主要有cps、mrp、ef、gdh等，其中gdh蛋白的编码基因在不同血清型的链球菌中高度保守，同源性约为96％～100％，并且gdh基因在链球菌中是高拷贝。大肠杆菌毒力因子众多有几十种，临床上分离出的大肠杆菌毒力因子差异巨大，猪中分离出的肠外大肠杆菌ompa检出率为100％。猪胸膜肺炎放线杆菌有四种apx毒素基因分别是apxⅰ、apxⅱ、apxⅲ以及apxⅳa，不同血清型的apxⅰ、apxⅱ、apxⅲ是不同的，这三种毒力基因并不存在于所有血清型，而apxⅳa则在不同血清型中高度保守，而且apxⅳa只特异性存在于猪胸膜肺炎放线杆菌，在其他放线杆菌中检测不到。巴氏杆菌有很多不同的血清型，不同血清型的毒力因子也有所不同，用kmt1基因克隆片段与巴氏杆菌pstⅰ酶切片段进行杂交，发现其抗原能与所有巴氏杆菌杂交，因此kmt1基因为巴氏杆菌的种特异性基因。副猪嗜血杆菌血清型众多，至少可分为15个血清型，目前对副猪嗜血杆菌的毒力因子还未有明确的定义，但对于多数细菌而言，荚膜、菌毛、外膜蛋白、脂多糖等被认为是重要的毒力因子，其中副猪嗜血杆菌的omp是重要的毒力因子之一，分为生物型1型和生物型2型，健康猪分离到的副猪嗜血杆菌omp多为1型，发病猪分离到的副猪嗜血杆菌omp多为2型，ompp2是一种参与副猪嗜血杆菌致病过程的多功能蛋白，在副猪嗜血杆菌引起的疾病发病机制中发挥着重要作用，并且副猪嗜血杆菌ompp2的基因也高度保守。

3、经检索，目前针对猪呼吸道疾病上述五种病原同时进行检测的pcr方法尚未有报道，基于此，我们设计了一种多重pcr引物，能快速且准确的检测出ss、e.coli、app、pm、hps五种病原菌，并选择链球菌的gdh基因，大肠杆菌的ompa基因，猪胸膜肺炎放线杆菌的apxⅳa基因，巴氏杆菌的kmt1基因和副猪嗜血杆菌的ompp2基因作为引物设计靶标，所设计的检测引物具有特异性高，灵敏度好等优点。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的是针对现有技术存在的不足，在于提供一种可以同时检测ss、e.coli、app、pm、hps五种猪呼吸道病原的多重pcr引物，解决临床检测过程中效率低耗费时间长等问题。

2、本发明是这样实现的：

3、申请人针对猪链球菌(ss)的gdh基因序列、大肠杆菌(e.coli)的ompa基因序列、猪胸膜肺炎放线杆菌(app)的apxⅳa基因序列、猪巴氏杆菌(pm)的kmt1基因序列、副猪嗜血杆菌(hps)的ompp2基因序列，根据多重pcr引物设计原则，设计了多组引物，以含有上述五个基因的重组质粒为模板，根据pcr扩增的准确性、特异性和灵敏性对所设计的多组引物进行筛选，最终得到一组多重pcr引物组合，其中：

4、序列为seq id no.1、seq id no.2的引物为检测链球菌的上游、下游引物；

5、序列为seq id no.3、seq id no.4的引物为检测大肠杆菌的上游、下游引物；

6、序列为seq id no.5、seq id no.6的引物为检测胸膜肺炎放线杆菌的上游、下游引物；

7、序列为seq id no.7、seq id no.8的引物为检测巴氏杆菌的上游、下游引物；

8、序列为seq id no.9、seq id no.10的引物为检测副猪嗜血杆菌的上游、下游引物。本发明设计的引物组能在一个pcr反应体系(单管一次性)中实现对五种猪呼吸道病原的扩增，极大地提高了扩增效率，且扩增产物条带相互之间无干扰且亮度高，无非特异性条带，因此具有很高的准确性、特异性和灵敏性。该引物组可用于ss、e.coli、app、pm、hps的检测及制备猪呼吸道病原检测试剂盒。

9、多重pcr不同于普通pcr，多重pcr的反应体系和反应条件影响二聚体、非特异性扩增以及扩增产物条带，因此相较引物，pcr的反应体系和条件对扩增效果的影响同样重要，基于此，我们继续对五重pcr的反应体系和条件进行了优化，最终得到反应体系和反应条件如下：

10、反应体系：模板5ul、多重pcr引物组10ul(每条引物各1ul)、mix液25ul、ddh2o10ul，总计50ul。其中，所述mix液含10u的taq酶，1.5mm的mg2+，0.35mm的dntp。

11、反应条件：94℃5min、94℃30s、55℃30s、72℃90s、72℃10min、4℃2h，其中94℃30s、55℃30s、72℃90s各循环35次。

12、最终，本发明建立的pcr方法能特异性扩增ss、e.coli、app、pm、hps产物，而对葡萄球菌，支原体，繁殖与呼吸综合征病毒，圆环2型病毒，圆环3型病毒，伪狂犬病毒，枯草芽孢杆菌等其它猪呼吸道病原无扩增产物，方法具有很高的特异性；同时，本发明建立的pcr方法产物条带清晰，对ss质粒的最低检测量为103拷贝，对e.coli质粒的最低检测量为104拷贝，对app质粒的最低检测量为102拷贝，对pm质粒的最低检测量为103拷贝，对hps质粒的最低检测量为103拷贝；对ss、e.coli、app、pm、hps核酸的检出限度为20pg/ul，方法也具有很高的敏感性。

13、本发明的有益效果是：

14、(1)本发明首次实现了对ss、e.coli、app、pm、hps五种猪呼吸道病原的单管一次性pcr检测，有利于更好地诊断猪呼吸道疾病，有针对性地进行疾病防控，另外也更有利于开展这五种病原的实验室筛查鉴定。

15、(2)本发明提供了一种用于检测猪呼吸道病原的多重pcr引物组，丰富了引物种类，为临床检测提供了更多的选择。在本发明中，尽管引物所针对的靶基因都是已知的，但没有人将这些靶基因用于多重pcr，本发明针对这些靶基因进行引物筛选，最终实现了多重pcr检测目的。

16、(3)本发明提供的引物和检测方法具有准确性高、特异性强、灵敏性好等优点。

17、(4)本发明还具有方法简便、快捷等优点。