检测NTRK基因融合的数字PCR引物探针组合物、试剂盒及方法与流程

本发明涉及基因检测领域，具体涉及使用数字pcr，特别是微滴式数字pcr(droplet digital pcr；ddpcr)法检测ntrk基因融合突变的引物探针组合物、包含所述引物探针组合物的试剂盒，以及使用所述引物探针组合物或试剂盒检测ntrk基因融合突变的方法。

背景技术：

1、ntrk(neutrotrophic tyrosine receptor kinase；神经营养因子受体激酶)是一种神经营养因子受体复合激酶，家族成员包括ntrk1、ntrk2和ntrk3基因。原肌球蛋白受体激酶(trk)家族包括三种蛋白质trka、trkb和trkc，在人类中它们分别由ntrk1、ntrk2和ntrk3基因编码。蛋白质trka、trkb和trkc通常在神经组织中表达。

2、神经营养蛋白激酶(ntrk)基因ntrk1、ntrk2和ntrk3分别编码原肌凝蛋白受体酪氨酸激酶trka、trkb和trkc，在正常的健康组织中，trk通路在中枢和外周神经系统的发育以及疼痛感觉方面发挥作用。ntrk基因重排导致trk蛋白受体的组成性激活，并可能促进支持肿瘤发生的致癌信号通路，如akt和mek通路。ntrk基因融合在多种癌症类型中被发现，包括脑癌、头颈癌、甲状腺癌、软组织癌、肺癌和结肠癌。

3、近年来已经确认ntrk基因的融合或突变与肿瘤形成密切相关。常见肿瘤的ntrk基因融合突变率很低，如肺癌、肠癌中突变率0.2％～3％，但在一些罕见肿瘤中，ntrk基因与其他基因的融合发生率非常高，包括婴儿纤维肉瘤、唾液腺癌和分泌性乳腺癌癌，发生率高达90％以上。这些融合的基因在机体中产生嵌合蛋白。trk嵌合蛋白是持续活跃的，并永久地激活着trk通路，进而驱动trk融合肿瘤的扩散和生长。其中，在ntrk基因的3’部分产生包含催化酪氨酸激酶域、与相关基因5’部分的内框融合，驱动基因表达，促进蛋白二聚体化等变化，与alk(anaplastic lymphoma kinase,间变性淋巴瘤激酶)和ros1(ros proto-oncogene 1,receptor tyrosine kinase,受体酪氨酸激酶)基因融合的致癌原理类似。

4、trk通路的失调会导致神经发育障碍和各种中枢神经系统(cns)疾病，并且当ntrk基因与无关基因融合时也会诱发癌症发展。ntrk融合蛋白充当致癌驱动因子，促进癌细胞生长和存活。目前，发现在超过25类癌症中出现ntrk的融合。

5、目前在研的有多款trk抑制剂如拉罗替尼(larotrectinib)、恩曲替尼(entrectinib)等。这些药物的获批打破了之前药物必须以疾病作为适应症的界限，而开启了药物可以以基因突变为适应症的先河。

6、恩曲替尼已获得美国fda突破性治疗认定(breakthrough therapy designation)的地位，用于治疗含有ntrk融合物的癌症。拉罗替尼是一种强效、高选择性的小分子抑制剂，可抑制所有三种trk蛋白，目前已在成人和儿童人群中并行开发。该药物已在一项ⅰ期研究中首次证明了在婴儿、儿童和青少年相关ntrk融合癌症中的安全性和高反应率(>肿瘤消退>90％)，从而建立了ntrk融合作为实体肿瘤或中枢神经系统肿瘤的一个易于处理的靶点。

7、这两个药物的使用都必须以患者携带ntrk基因融合突变为前提，因此快速、准确地检测ntrk基因触合突变作为这些药物的伴随诊断，对这些药物的临床选择至关重要。

8、目前用于ntrk基因融合检测的方法主要有免疫组织化学法(ihc)、荧光原位杂交技术(fish)、逆转录聚合酶链式反应法(rt-pcr)法和高通量测序法(ngs)等。ihc法是应用免疫学抗原与抗体特异性结合的原理检测肿瘤特异性抗原表达，是识别ntrk基因重排的一种有价值的工具，具有灵敏度高且筛选快速，但ihc法理论上只能检测表达的融合蛋白，判断上存在一定主观性，对于弱阳性结果需进一步用fish等技术来验证。

9、fish技术是一种常用的检测染色体重排的方法，利用靶dna与荧光标记的核酸探针同源互补，形成靶dna与核酸探针的杂交体，在荧光显微镜下对待测dna进行定性、定量和相对定位分析，但该技术对于融合的两个基因在染色体位置上距离较近时，可能导致重排的分离信号不明显，产生假阴性结果，且成本较高，检测周期较长。

10、ngs法也可以用于检测基因融合，但成本高，操作相对比较复杂，对实验人员的技术要求较高、耗时长，通常要3～5天才可出检测结果。

11、传统的qpcr法对已知的基因融合可靠，但其定量需要参考标品、标准曲线和内标校正，对有限的标本材料以及低拷贝数的准确定量仍存在一定的应用限制。

12、数字pcr(digital pcr，dpcr)通过分区扩增后检测所有反应单元中的荧光信号，利用数学模型(泊松分布)矫正直接计算出目标靶分子的浓度或拷贝数。可以无需对照标准样品和标准曲线，不依赖于ct值来实现绝对定量分析。

13、数字pcr可分为两大类：微阵列芯片式数字pcr(chip digital pcr，cdpcr)和微滴式数字pcr(droplet digital pcr，ddpcr)。微阵列芯片式pcr主要通过芯片设计，在芯片上蚀刻微孔方阵，将纳升级的液体封闭在高通量的微池或微量通道中进行后续的pcr扩增及结果判读。

14、微滴式数字pcr主要是设计带有微流道通道和反应腔室的芯片，用分析化学领域的微流控或微滴化方法，在反应腔室内通过油水两相间隔得到成千上万个微小液滴，pcr扩增后通过统计液滴的荧光信号根据泊松分布计算目标基因的拷贝数。

15、与实时荧光定量pcr技术相比，数字pcr不依赖于扩增曲线的阈值(ct)进行定量。这种以单个油包水液滴为单位的pcr反应体系更容易实现小体积和高通量，使得稀有检测片段从大量的复杂背景中分离出来，将扩增信号富集于一个微滴或微反应室中，而且系统简单，成本低，具有绝对定量、高灵敏度、高耐受性和重复性、高定量精确度的优点。

16、本领域仍然需要针对ntrk基因融合突变的检测开发适用于数字pcr的引物探针组合，从而能够以一种简单、高效、准确的方式对感兴趣的突变进行检测。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，发明人设计了一系列引物和探针，具体包括6组引物与探针的组合(下文中称为“引物探针组”)，其能够精准定量并分型检测6种ntrk1、ntrk2、ntrk3基因与其他基因的融合突变。这6种待检测的ntrk基因融合突变包括ntrk与选自下组的任一基因形成的基因融合：tpm3(原肌球蛋白3)、nacc2(nucleus accumbens associated protein2)、etv6(ets变体基因6，ets variant 6，tel1)、lmna(核纤层蛋白)、qki(kh结构域rna结合信号转导相关，kh domain containing rna binding)。在具体的实施方案中，检测的ntrk基因融合突变类型选自下组：tpm3(e8)-ntrk1(e10)、nacc2(e4)-ntrk2(e13)、etv6(e4)-ntrk3(e14)、lmna(e2)-ntrk1(e11)、qki(e6)-ntrk2(e16)、etv6(e5)-ntrk3(e15)。

2、利用这些引物和探针的组合，能够实现在较短时间内通过数字pcr法检测受试者的样品中是否存在上述ntrk基因融合突变。在此基础上此，本发明建立了检测ntrk基因融合突变的数字pcr体系。该体系可广泛应用于不同来源的样品，包括新鲜组织、石蜡包埋组织或冰冻病理切片，对受试者用药及病情进展等具有参考意义，由此完成了本发明。

3、因此，本发明第一方面涉及一种检测ntrk基因融合突变的引物探针组合物，其包含下述一种或多种引物探针组：

4、用于检测ntrk1基因融合突变类型的引物探针组a、d；

5、用于检测ntrk2基因融合突变类型的引物探针组b、e；

6、用于检测ntrk3基因融合突变类型的引物探针组c、f；

7、其中，

8、所述引物探针组a检测涉及ntrk1第10外显子(ntrk1(ex10))的基因融合；

9、所述引物探针组b检测涉及ntrk2第8外显子(ntrk2(ex13))的基因融合；

10、所述引物探针组c检测涉及ntrk3第14外显子(ntrk3(ex14))的基因融合；

11、所述引物探针组d检测涉及ntrk1第11外显子(ntrk1(ex11))的基因融合；

12、所述引物探针组e检测涉及ntrk2第16外显子(ntrk2(ex16))的基因融合；

13、所述引物探针组f检测涉及ntrk3第15外显子(ntrk3(ex15))的基因融合。

14、特别地，上述ntrk基因融合为ntrk与伙伴(partner)基因的融合。具体地，所述ntrk基因融合的形式是从5’至3’方向为伙伴基因部分-ntrk基因部分的框内(in-frame)融合，所述ntrk基因选自ntrk1、ntrk2和ntrk3。

15、在第一方面的一些实施方案中，各个引物探针组检测的基因融合类型如下所示：

16、所述引物探针组a检测ntrk1与tpm3外显子8(tpm3(e8))的基因融合；

17、所述引物探针组b检测ntrk2与nacc2外显子4(nacc2(e4))的基因融合；

18、所述引物探针组c检测ntrk3与etv6外显子4(etv6(e4))的基因融合；

19、所述引物探针组d检测ntrk1与lmna外显子2(lmna(e2))的基因融合；

20、所述引物探针组e检测ntrk2与qki外显子6(qki(e6))的基因融合；

21、所述引物探针组f检测ntrk3与etv6外显子5(etv6(e5))的基因融合。

22、在第一方面更具体的实施方案中，所述ntrk基因融合突变选自tpm3(e8)-ntrk1(e10)、nacc2(e4)-ntrk2(e13)、etv6(e4)-ntrk3(e14)、lmna(e2)-ntrk1(e11)、qki(e6)-ntrk2(e16)和etv6(e5)-ntrk3(e15)中的一种或多种。

23、在第一方面更具体的实施方案中，所述引物探针组合物包括一组或多组选自下述的引物探针组：

24、引物探针组a，包含具有seq id no:1～2所示的序列的引物和具有seq id no:3所示的序列的探针，其用于检测tpm3(e8)-ntrk1(e10)；

25、引物探针组b，包含具有seq id no:4～5所示的序列的引物和具有seq id no:6所示的序列的探针，其用于检测nacc2(e4)-ntrk2(e13)；

26、引物探针组c，包含具有seq id no:7～8所示的序列的引物和具有seq id no:9所示的序列的探针，其用于检测etv6(e4)-ntrk3(e14)；

27、引物探针组d，包含具有seq id no:10～11所示的序列的引物和具有seq id no:12所示的序列的探针，其用于检测lmna(e2)-ntrk1(e11)；

28、引物探针组e，包含具有seq id no:13～14所示的序列的引物和具有seq id no:15所示的序列的探针，其用于检测qki(e6)-ntrk2(e16)；

29、引物探针组f，包含具有seq id no:16～17所示的序列的引物和具有seq id no:18所示的序列的探针，其用于检测etv6(e5)-ntrk3(e15)。

30、在优选的实施方案中，所述引物探针组合物包含引物探针组a、引物探针组b、引物探针组c、引物探针组d、引物探针组e和引物探针组f。

31、在优选的实施方案中，所述引物探针组合物用于数字pcr，优选微滴式数字pcr(ddpcr)。

32、第二方面，本发明提供一种检测ntrk基因融合突变的试剂盒，所述试剂盒包括下述引物探针组中的一条或多条引物或探针：

33、引物探针组a，包含具有seq id no:1～2所示的序列的引物和具有seq id no:3所示的序列的探针，其用于检测tpm3(e8)-ntrk1(e10)；

34、引物探针组b，包含具有seq id no:4～5所示的序列的引物和具有seq id no:6所示的序列的探针，其用于检测nacc2(e4)-ntrk2(e13)；

35、引物探针组c，包含具有seq id no:7～8所示的序列的引物和具有seq id no:9所示的序列的探针，其用于检测etv6(e4)-ntrk3(e14)；

36、引物探针组d，包含具有seq id no:10～11所示的序列的引物和具有seq id no:12所示的序列的探针，其用于检测lmna(e2)-ntrk1(e11)；

37、引物探针组e，包含具有seq id no:13～14所示的序列的引物和具有seq id no:15所示的序列的探针，其用于检测qki(e6)-ntrk2(e16)；

38、引物探针组f，包含具有seq id no:16～17所示的序列的引物和具有seq id no:18所示的序列的探针，其用于检测etv6(e5)-ntrk3(e15)；

39、所述各个引物探针组包含在不同的容器中。进一步地，特定引物探针组中的引物和探针可以包含在同一容器中，或包含在不同的容器中。

40、在第二方面的优选实施方案中，所述引物探针组合物包含引物探针组a、引物探针组b、引物探针组c、引物探针组d、引物探针组e和引物探针组f中的一组或多组。

41、在第二方面更优选的实施方案中，所述引物探针组合物包含引物探针组a、引物探针组b、引物探针组c、引物探针组d、引物探针组e和引物探针组f。

42、在优选的实施方案中，所述试剂盒用于数字pcr，优选微滴式数字pcr(ddpcr)。

43、第三方面，本发明涉及第一方面的引物探针组合物或第二方面的试剂盒的用途，其用于通过数字pcr检测ntrk基因融合突变。

44、在具体的实施方案中，所述用途包括检测受试者样本中是否存在ntrk基因融合突变，或用于鉴别受试者样本中ntrk基因融合突变的类型。

45、第四方面，本发明涉及一种用于检测样本中ntrk基因融合突变的存在或类型的方法，包括使用第一方面的引物探针组合物或第二方面的试剂盒，所述样本为细胞、组织，例如新鲜组织、石蜡包埋组织或冰冻病理切片。

46、在具体的实施方案中，所述方法包括：

47、(a)提供来自所述样本的分离的核酸；

48、(b)使用所述引物探针组合物中的每一组引物探针组，对所述样品进行ddpcr检测。

49、在一些实施方案中，所述样品中的ntrk基因融合类型是未知的，所述方法包括使用前述引物探针组a-f中的一组或多组，优选使用全部6组。

50、在一些实施方案中，所述样品中的ntrk基因融合类型是已知的，所述方法包括使用前述引物探针组a-f中与所述融合类型相对应的引物探针组。

51、第五方面，提供用于第四方面的方法的反应体系，所述反应体系包含第一方面的引物探针组合物。

52、在本发明各个方面的优选实施方案中，针对上述类型的融合突变的特异性探针在5’端带有荧光基团，例如fam、hex、rox、cy5，优选为fam；和/或在3’端带有非荧光淬灭基团，例如bhq1。

53、综上，本发明提供了一种基于数字pcr精准定量分型检测ntrk基因融合突变的引物、探针及试剂盒，其优点至少在于如下方面：

54、(1)建立了数字pcr检测体系，实现对ntrk基因融合突变的快速检测；

55、(2)用时短，只需150分钟即可完成检测；

56、(3)检测结果判读方便，特异性强，根据有无扩增信号即可判定结果；

57、(4)灵敏度高；

58、(5)样本检测范围广，样本可以为新鲜组织、石蜡包埋组织或冰冻病理切片，因此可以定量检测微小残留病灶。