利用SSR指纹图谱鉴别岳西古茶树1号的方法

本发明涉及一种利用ssr指纹图谱鉴别岳西古茶树1号的方法，属于分子生物学。

背景技术：

1、古茶树，是指树龄100年以上的野生茶树或栽培型茶树。古茶树大部分生长在空气清洁、生态环境良好、远离城市的山林中。在茶与天然林复合生态环境下生长的古树茶品质独特、安全，其独特的风味深受消费者喜爱，非常畅销。目前茶农种植以及改良的茶树品种大部分是从古茶树中选育而来。

2、近些年来，随着国家对古茶树保护条例的不断完善，越来越多的育种者对古茶树保护的意识增强，积极申请古茶树保护。这其中，对古茶树进行精准鉴定是保护、研究、利用古茶树的重要措施。

3、ssr指纹图谱技术是一种分子标记技术，是近年来随着分子生物学发展而发展起来的一种应用性遗传种质分析方法，具有稳定性好、操作简单、准确率高等优点，近年来在植物遗传多样性分析、种质鉴定、品种进化分析等方面得到了广泛的应用。

4、本申请的发明人在安徽省各地走访中发现岳西县竹山古茶园中存在一颗有300～500年历史的古茶树(照片如图1所示)，标记为岳西古茶树1号，该古茶树叶形独特，植株特征为：灌木型，树姿半开张，中叶类，叶椭圆形，叶色深绿，叶面隆起，叶身稍内折，叶缘平，叶尖渐尖，叶齿锐度中等、较密，叶质较硬(叶片的照片如图2所示)。抗病虫害和抗逆境能力较强，来自岳西县的省级良种“石佛翠”有可能是从该古茶树上选育而来，或者和该古茶树亲缘关系较近。但是本地并没有对其进行有效管理和保护。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明提供了一种利用ssr指纹图谱鉴别岳西古茶树1号的方法。本发明还提供了用于鉴别岳西古茶树1号的ssr引物。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一种利用ssr指纹图谱鉴别岳西古茶树1号的方法，包括以下步骤：

4、(1)提取待检测植株的基因组dna；

5、(2)以待测植株的基因组dna为模板，利用ssr引物分别进行pcr扩增；

6、所述ssr引物包括4对特异性引物，具体如下：

7、ssr 1-f：5’-gtaccattcctcaattgggttc-3’，如seq id no.13所示；

8、ssr 1-r：5’-tttattttccacgagttcttat-3’，如seq id no.14所示；

9、ssr 9-f：5’-agtctctatcaccgaccatcac-3’，如seq id no.15所示；

10、ssr 9-r：5’-ctgacctggaaaattcctcgac-3’，如seq id no.16所示；

11、ssr 14-f：5’-cccaaatgctctattagtctca-3’，如seq id no.17所示；

12、ssr 14-r：5’-agtcagtcttcttctttgtcct-3’，如seq id no.18所示；

13、ssr 34-f：5’-gaatcctgaaactgaattgtcc-3’，如seq id no.19所示；

14、ssr 34-r：5’-gtaggaataagaggcaccacaa-3’，如seq id no.20所示；

15、3)检测pcr扩增产物，如果同时满足以下条件，则表明待测植株的品种为岳西古茶树1号：

16、①ssr引物ssr 1-f/r的扩增产物中出现186bp的特征条带；

17、②ssr引物ssr 9-f/r的扩增产物中出现203bp和206bp的特征条带；

18、③ssr引物ssr 14-f/r的扩增产物中出现243bp和246bp的特征条带；

19、④ssr引物ssr 34-f/r的扩增产物中出现199bp和213bp的特征条带。

20、进一步地，所述步骤(1)中，待检测植株选自谷雨香、石佛翠、岳西901、石佛香、铁观音、舒茶早、安徽3号、迎霜、浙农117、槠叶齐、岳西古茶树1～19号中的任意一种或两种以上。

21、进一步地，所述步骤(1)中，采用ctab法从待检测植株的鲜叶或干茶中提取基因组dna。

22、进一步地，所述步骤(2)中，pcr扩增的反应总体系为10μl，其中，30～50ng/μl的dna样品，1.2μl；10μm上下游引物，各0.5μl；2×taq plus master mix，5μl；ddh2o加至10μl。

23、进一步地，所述步骤(2)中，pcr扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。

24、进一步地，所述步骤(3)中，采用毛细管电泳检测pcr扩增产物。

25、用于鉴别岳西古茶树1号的ssr引物，包括上述4对特异性引物。

26、所述ssr引物在鉴别岳西古茶树1号中的应用。

27、本发明的利用ssr指纹图谱鉴别岳西古茶树1号的方法，不受季节、环境和测试时间的限制，可以对古茶树任何生长时期内的任意器官或者制作好储存一段时间的干茶进行dna提取和鉴别。本发明所开发的4对ssr引物，数量丰富且覆盖整个基因组，揭示的多态性高，提供的信息量高，特异性强，可精准鉴定岳西古茶树1号。

28、本发明进行引物筛选时选用的是fragment analyzer tm全自动毛细管电泳系统，具有以下优点：(1)所需样品量少、仪器简单、操作简便；(2)分析速度快，分离效率高，分辨率高，灵敏度高；(3)操作模式多，开发分析方法容易；(4)应用范围极广，对构建一套快速、精确的ssr指纹图谱技术起到很大的作用，并缩短了古茶树品种鉴定的周期。

29、本发明利用ssr指纹图谱鉴别岳西古茶树1号的方法，可对岳西古茶树1号进行了精准鉴定，将其与其它茶树品种(包括经过品种认定的国家级品种、省级良种、优良的农家种)以及岳西未认证的古茶树(包括岳西古茶树2～19号)区分开。本发明从dna水平上给予了岳西古茶树1号一个指纹身份，有利于下一步育种者对其进行有效保护和品种利用。本发明为岳西选育新的茶树优良品种提供了分子基础。

技术特征：

1.一种利用ssr指纹图谱鉴别岳西古茶树1号的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的利用ssr指纹图谱鉴别岳西古茶树1号的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，待检测植株选自谷雨香、石佛翠、岳西901、石佛香、铁观音、舒茶早、安徽3号、迎霜、浙农117、槠叶齐、岳西古茶树1～19号中的任意一种或两种以上。

3.根据权利要求1所述的利用ssr指纹图谱鉴别岳西古茶树1号的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，采用ctab法从待检测植株的鲜叶或干茶中提取基因组dna。

4.根据权利要求1所述的利用ssr指纹图谱鉴别岳西古茶树1号的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，pcr扩增的反应总体系为10μl，其中，30～50ng/μl的dna样品，1.2μl；10μm上下游引物，各0.5μl；2×taq plus master mix，5μl；ddh2o补至10μl。

5.根据权利要求1所述的利用ssr指纹图谱鉴别岳西古茶树1号的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，pcr扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃终延伸5min，4℃保存。

6.根据权利要求1所述的利用ssr指纹图谱鉴别岳西古茶树1号的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，采用毛细管电泳检测pcr扩增产物。

7.用于鉴别岳西古茶树1号的ssr引物，其特征在于：包括4对特异性引物，具体如下：

8.权利要求7所述的ssr引物在鉴别岳西古茶树1号中的应用。

技术总结
本发明公开了一种利用SSR指纹图谱鉴别岳西古茶树1号的方法，包括以下步骤：(1)提取待检测植株的基因组DNA；(2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用SSR引物分别进行PCR扩增；所述SSR引物包括4对特异性引物，如SEQ ID NO.13～20所示；(3)检测PCR扩增产物，鉴别待测植株是否为岳西古茶树1号。本发明还公开了用于鉴别岳西古茶树1号的SSR引物，包括4对特异性引物，如SEQ ID NO.13～20所示。本发明的利用SSR指纹图谱鉴别岳西古茶树1号的方法，可对岳西古茶树1号进行了精准鉴定。本发明从DNA水平上给予了岳西古茶树1号一个指纹身份，有利于下一步育种者对其进行有效保护和品种利用。

技术研发人员：刘升锐,陶玲玲,韦朝领,朱俊彦,费月
受保护的技术使用者：安徽农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15