一种乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒及其使用方法与流程

本发明涉及生物，具体地说，涉及一种乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒及其使用方法。

背景技术：

1、乙型肝炎病毒（hbv）感染是慢性肝病的主要原因。据估计，全世界有近20亿人感染了乙肝病毒，超 过3.5亿人持续慢性感染。乙肝病毒携带者发展为乙肝长期后遗症的风险很高，包括肝硬变和肝细胞癌，在像意大利这样的乙肝病毒感染中等流行的国家，这些疾病占参考中心肝移植适应症的近25%。基于新的和更强大的核苷类似物的开发，抗病毒治疗的最新进展极大地改善了慢性乙肝的管理，包括预防因乙肝病毒相关疾病而接受肝移植的患者的移植物再感染。

2、传统临床上对于乙型肝炎病毒携带者的检测多选用血清血标标志物法，主要检测样本为患者血液，在临床血清学检测过程中会因操作失误导致检测人员感染的情况。且传统的血清检测是一种定性的检查方法，了解机体免疫状态及间接反应病毒的复制情况，但当病毒发生变异或处于窗口期时，该方法具有局限性，导致假阴性结果。而乙型肝炎病毒核酸(hbvdna)检测可直接反映机体内hbv的复制情况，对乙型肝炎感染情况的诊断、药物疗效监测、预后判断都具有极其重要的意义。所以为了保证乙肝患者检测结果的准确性，本发明采用实时荧光定量pcr法对乙肝病毒dna进行检测评价该方法在临床检查中的应用价值。

技术实现思路

1、本发明提供一种乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒及其使用方法。可以高效、灵敏地对血液样本中乙型肝炎病毒载量进行检测，能保证患者的及时诊治及治疗效果监测，适合于大规模临床开展。

2、本发明提供一种乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒，包括pcr反应液和内标，所述pcr反应液包括乙型肝炎病毒靶基因的引物探针hbv-f、hbv-r和hbv-p，所述pcr反应液还包括内标基因的引物探针ic-f、ic-r和ic-p，所述hbv-p和所述ygnb-p为荧光探针，其中，

3、hbv-f：5' gacaaacagtattacagcatagttttaatg 3'；

4、hbv-r：5'agttagtttgaggatacctttgaattatc3'；

5、hbv-p：5'ctgcccactccgaatcgtgctgaccagtttga3'；

6、ic-f：5'agatttggacctgcgagcg3'；

7、ic-r：5'gagcggctgtctccacaagt3'；

8、ic-p：5'ttctgacctgaaggctctgcgcg3'。

9、应用上述技术方案中的试剂盒，可以高效、灵敏地对血液样本中乙型肝炎病毒载量进行检测，检出范围广，检出下限低，能够保证患者病毒的检出，同时，引物探针hbv-f和hbv-r用于扩增乙型肝炎病毒c基因区基因，c基因区为乙型肝炎病毒核心抗原，特异性强，准确度高。因此，所述试剂盒能够为患者的疾病诊断提供依据并且在治疗过程中使用，能够为患者的治疗效果提供监测依据，适合于大规模的临床使用。

10、本发明的一种技术方案中，所述试剂盒还包括定量标准品a、定量标准品b、定量标准品c、定量标准品d、第一阳性对照品、第二阳性对照品和阴性对照品。所述定量标准品a、所述定量标准品b、所述定量标准品c、所述定量标准品d为具有浓度梯度的四个不同浓度的含有目标基因的标准品，优选的一种技术方案中，所述定量标准品a、所述定量标准品b、所述定量标准品c、所述定量标准品d、所述第一阳性对照品和所述第二阳性对照品为含有乙型肝炎病毒核酸片段的重组质粒，所述定量标准品a、所述定量标准品b、所述定量标准品c、所述定量标准品d的浓度分别为5×106iu/ml、5×105iu/ml、5×104iu/ml、5×103iu/ml。本发明技术方案中，所述第一阳性对照品和所述第二阳性对照品为含有两种不同浓度目标基因的对照品，所述第一阳性对照品为强阳性对照品，选取范围为1.58×104~1.58×108 iu/ml，优选的技术方案中，所述第一阳性对照品浓度为1.58×105~1.58×106 iu/ml；所述第二阳性对照品为弱阳性对照品，选取范围为1.58×105~1.58×108 iu/ml，优选的技术方案中，所述第二阳性对照品浓度为158~1.58×104 iu/ml 。

11、本发明的一种技术方案中，所述内标为外源性克隆质粒，扩增目的dna片段，内标引物探针为ic-f、ic-r、ic-p，其中，ic-f：5'agatttggacctgcgagcg3'；ic-r：5'gagcggctgtctccacaagt3'；ic-p：5'ttctgacctgaaggctctgcgcg3'。ic-p为荧光探针。

12、本发明优选的技术方案中，pcr反应液可分为两部分pcr反应液a和pcr反应液b，其中，pcr反应液a包括dntp、mg2+、dna聚合酶、ung酶、和tris-hcl缓冲液，pcr反应液b包括hbv-f、hbv-r、hbv-p、ic-f、ic-r和ic-p。在此技术方案中，ung酶能够消除由于污染dna产生的扩增，从而保证扩增结果的特异性，准确性。

13、本发明一种技术方案中，所述hbv-p的5’端，标记有荧光基团，所述hbv-p在除 5’端外的任意一个位置上标记有淬灭基团。

14、所述hbv-p的5’端的所述荧光基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、vic荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-x-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5和花菁5.5中的至少一种；和/或，

15、所述淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1、黑洞淬灭剂2和黑洞淬灭剂3中的至少一种。

16、所述ic-p的5’端的所述荧光基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、vic荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-x-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5和花菁5.5中的至少一种，同时，应当注意的是，所述ic-p的5’端的所述荧光基团不能与所述hbv-p的5’端的所述荧光基团选取种类重合或部分重合；和/或，

17、所述淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1、黑洞淬灭剂2和黑洞淬灭剂3中的至少一种。

18、本领域技术人员应当注意的是，本发明中部分化合物存在中英文名称互相替代，以下为部分列举，本发明中若出现其他中文或英文名，可在本领域技术文件中查询得到，而不应该看做是对本
技术实现要素：
的限制。以下为部分列举出的荧光基团与淬灭集团：6-羧基荧光素(6-fam)、六氯-6-甲基荧光素(hex)、vic（亚磷酰胺）荧光染料、四氯-6-羧基荧光素(tet)、7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯(joe)、花菁3(cy3)、花菁5(cy5)和花菁5.5(cy5.5)、6-羧基四甲基罗丹明(tamra)、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸(dabcyl)、黑洞淬灭剂1(bhq1)、黑洞淬灭剂2(bhq2)和黑洞淬灭剂3(bhq3)。

19、一种优选的技术方案中，所述hbv-p的5’端由6-fam荧光标记，所述hbv-p的3’端由bhq（包括黑洞淬灭剂1、黑洞淬灭剂和黑洞淬灭剂3任选一种）荧光标记；所述ic-p的5’端由vic荧光标记，所述ic-p的3’端由bhq荧光（包括黑洞淬灭剂1、黑洞淬灭剂和黑洞淬灭剂3任选一种）标记。

20、本发明一种技术方案为一种应用试剂盒检测乙型肝炎病毒核酸的使用方法，包括以下步骤：

21、（1）处理待测样本，提取待测样本核酸且加入内标；

22、（2）对待测样本、定量标准品a、定量标准品b、定量标准品c、定量标准品d、第一阳性对照品和第二阳性对照品进行pcr反应；

23、（3）反应条件设置为：94℃变性5分钟；然后94℃15s，56℃30s（并采集荧光），共45个循环；

24、（4）通过荧光定量pcr仪检测反应结果。

25、荧光定量 pcr 仪检测反应结果，采用荧光定量 pcr仪，荧光信号收集时设定为对应hbv-p荧光基团的荧光素，优选的技术方案中，hbv-p荧光基团采用6-fam荧光素，荧光信号收集设在56℃。

26、荧光定量 pcr 仪检测反应结果，如果检测通道没有出现 s 型扩增曲线，判为hbv阴性 ；如果检测通道出现 s 型扩增曲线，则判定为阳性，并利用 hbv 定量标准品检测所生成的标准曲线计算待测样本的浓度 (iu/ml)。

27、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

28、1、利用本发明的试剂盒可以快速、简便、高效、灵敏地对血液样本中乙型肝炎病毒载量进行测试，因而能保证及时的病例诊治及治疗效果监测，适合于大规模临床开展。

29、2、本发明的检测方法反应快速、敏感性高，一般1.5到2小时即可得到反应结果，并且成本低、无假阳性，最低检出可达到30iu/ml，适合于大规模临床开展，从而实现对hbv的快速、有效且准确的定量检测；

30、3、本发明的检测方法的特异性很好，不和其他的病毒发生交叉反应，例如丙肝病毒(hcv)，eb病毒(ebv)，人巨细胞病毒(hcmv)，人类细小病毒b19(hpvb19)和bk病毒(bkv)等。

31、