一种基于滚环扩增技术检测二尖梅奇酵母的试剂盒及方法

本发明属于生物样品检测，具体涉及一种基于滚环扩增技术检测二尖梅奇酵母的试剂盒及方法。

背景技术：

1、二尖梅奇酵母(metschnikowia bicuspidate，m.bicuspidate)隶属于梅奇酵母属(metschnikowia)，是一种首次在水蚤中发现的条件致病性酵母菌，病原体本身、宿主和宿主所在环境之间的关系都能够对其致病性产生决定性影响。由该病原引起的中华绒螯蟹“牛奶病”的主要症状表现为病蟹活力减弱、行动迟缓，步足易脱落、折断后有乳白色液体流出，鳃盖内积聚大量牛奶样液体，肝胰腺呈亮黄色，鳃丝不规则排列等。“牛奶病”是2018年以来中华绒螯蟹最严重的病害之一，严重损害了蟹类养殖的经济效益，2018年辽宁盘锦地区中华绒螯蟹出现“牛奶病”，死亡率超过20％，并确定其病原为二尖梅奇酵母；2020年4-5月，天津地区的中华绒螯蟹感染m.bicuspidate后发病率达到90％，死亡率达到50％以上。报道显示，中国北方许多中华绒螯蟹养殖场均经历了严重的二尖梅奇酵母感染，来自越冬池塘的成年蟹的感染率超过了30％。该病随苗种传播，死亡率高达100％，危害非常严重。目前，尚无针对该病的有效治疗药物。

2、养殖蟹类受真菌、细菌等病原侵染时，由于病原个体微小和养殖水体中微生物多样性等因素，难以根据感染初期症状进行诊断，因此，早期、及时且准确的检测与诊断对于科学防治养殖蟹类疾病的发生极为重要。对于二尖梅奇酵母的诊断和检测是该病防控的重要部分。

3、针对二尖梅奇酵母的分子生物学检测，目前以聚合酶链式反应(polymerasechain reaction，pcr)方法为主，但是常规pcr检测灵敏度低，不能在疾病早期，即症状较轻时及时检测。也有较pcr检测方法更特异和更灵敏的基于hyr-巢式pcr检测m.bicuspidate的方法，但由于内引物扩增的模板是外引物扩增的产物，第二次扩增步骤极易出现污染。且上述基于pcr的变温扩增方法对检测设备有着较强的依赖性，无法满足养殖现场的检测需求，限制了此方法的应用。

4、滚环扩增技术是近年来发展起来的一种等温扩增核酸检测技术，是借鉴自然界中病毒或质粒环dna复制机理而形成的一种信号放大的核酸检测方法，相较于变温扩增技术，优点在于滚环扩增技术不需要依赖昂贵的变温设备，常温下就可以进行，且操作更为便捷，灵敏度高、扩增能力强，具有高序列特异性，可以区分单一位点的不同模式等。rca已广泛应用到细胞、dna、rna、蛋白质和小分子检测中，但在水产病原菌及寄生虫的检测中则鲜有报道。

技术实现思路

1、为解决蟹类等生物样品中二尖梅奇酵母检测设备昂贵、过程繁琐、灵敏度低等技术问题，本发明的目的是提供了一种基于滚环扩增技术检测二尖梅奇酵母的试剂盒及方法，本发明利用二尖梅奇酵母的特异性靶标序列，在寡核苷酸的5’和3’端设计与靶标序列互补配对的核酸探针(plp)，结合rca技术反应时间短(60min)，特异性高(能区分出一个碱基)，常温反应(37℃)，灵敏度较高(检出至fmol的靶标)等优点，实现生物样本中二尖梅奇酵母低成本、快速、灵敏、简便、可常温反应的定性检测。将其用于中华绒螯蟹“牛奶病”病原二尖梅奇酵母检测中的应用，是该技术在水产领域应用的一项重大突破。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供一种用于检测二尖梅奇酵母的特异性靶标，所述靶标的核苷酸序列如seq id no.1所示。

4、本发明另一方面提供一种基于滚环扩增技术扩增所述的特异性靶标的引物探针组，引物探针组包括锁式探针plp和滚环扩增引物，锁式探针plp的核苷酸序列如seq idno.3所示，滚环扩增引物的序列如seq id no.4或seq id no.5所示。

5、基于上述技术方案，进一步地，所述锁式探针plp的5’端标记有磷酸化基团。

6、本发明还提供了基于滚环扩增技术检测二尖梅奇酵母的试剂盒，包括所述引物探针组以及获得二尖梅奇酵母的特异性靶标所需的不对称pcr的上游引物、下游引物。

7、基于上述技术方案，进一步地，不对称pcr上游引物的核苷酸序列如seq id no.6所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.7所示。

8、基于上述技术方案，进一步地，试剂盒还包括t4 dna ligase、exonuclease i、exonuclease iii、phi 29dna聚合酶、t4 dna ligase buffer、phi 29dna polymerasebuffer、dntps、无菌水和sybr green ii。

9、基于上述技术方案，进一步地，所述试剂盒的检测方法包括以下步骤：

10、(1)连接反应：10×t4 dna ligase buffer 1μl、锁式探针plp 1μl、10μm二尖梅奇酵母特异性靶标1μl、t4 dna ligase 0.5μl，无菌水补至10μl，体系在37℃下反应10min，在72℃下反应10min；

11、(2)酶切反应：将步骤(1)得到的连接反应产物中加入exonuclease i和exonuclease iii各0.25μl对连接反应产物进行酶切，去除多余碱基；

12、(3)rca扩增反应：rca反应体系：10×phi 29dna polymerase buffer 5μl、10μmdntps 2.5μl，1％ sybr green ii 1μl、滚环扩增引物2μl，步骤(2)得到的连接反应产物2μl，phi 29聚合酶，无菌水补至50μl，35～38℃反应60min，使用荧光定量pcr仪实时检测。

13、基于上述技术方案，进一步地，锁式探针plp的浓度为1μm以上，滚环扩增引物与锁式探针plp的浓度比≥1，phi 29聚合酶≥1u。

14、基于上述技术方案，进一步地，步骤(2)的条件为在37℃下反应30min，然后在90℃下温育20min。

15、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

16、(1)本发明将待测的二尖梅奇酵母检测转化成为对rca扩增产物信号检测，rca对信号具有线性放大的优点，并通过荧光信号判定扩增产物的存在，因此能够较为灵敏地检测二尖梅奇酵母的存在。

17、(2)rca为恒温扩增反应，适用于便携式检测设备，因此便于对二尖梅奇酵母进行实际生产的现场检测。

18、(3)本发明的检测方法特异性强，检测准确度高，既确定了与二尖梅奇酵母相邻物种(metschnikowia australia、metschnikowia zobellii、metschnikowia agaveae、clavispora opuntiae、candida.oleophila)无交叉反应，也确定了与细菌性病原(vibrio.alginolyticus、pseudomonas.putida)、病毒性病原(grass carp hemorrhagicvirus、cyprinid herpesvirus 3)以及寄生虫病原(hematodinium sp.、hepatospora.eriocheir)均无交叉反应，为二尖梅奇酵母引发“牛奶病”的现场检测提供了新的方法，对水产动物的疾病防控具有重要意义。

19、(4)本发明提供的基于滚环扩增技术检测二尖梅奇酵母的方法，与现有检测二尖梅奇酵母的方法相比，具有检测成本低、操作简便、反应快速、敏感性和特异性高等优势。