一种基于ERA技术的基孔肯雅病毒检测用P2型成套探针引物组及试剂盒和应用的制作方法

本发明涉及一种基于era技术的基孔肯雅病毒检测用p2型成套探针引物组及试剂盒和应用，属于生物。

背景技术：

1、基孔肯雅病毒(chikungunya virus,chikv)是一种rna病毒，属于披膜病毒科甲型病毒属，是导致基孔肯雅热(chikungunya fever)的病原体。基孔肯雅热经伊蚊传播，以发热、皮疹及关节痛为主要临床特征。人和灵长类动物是chikv的主要宿主，急性期患者、隐性感染者和感染病毒的灵长类动物是该病的主要传染源。该病毒主要分布在非洲、东南亚等地区，近年来在印度洋地区造成大规模流行。我国目前以输入性病例为主，但后续大规模流行的风险不容忽视，迫切需要现场快速检测方法用于监测和预警。

2、病原现场快速检测方法的金标准为病原核酸检测技术，主要有变温扩增技术(如pcr技术)、等(恒)温扩增技术(如日本学者发明的lamp扩增技术)、基因芯片技术三大类。其中等温扩增技术是在病原核酸的现场快速检测中最有优势。目前主要的恒温扩增技术有：环介导等温扩增(lamp)、切口内切酶恒温扩增技术(near)、依赖核酸序列扩增(nasba)、滚环核酸扩增(rca)、解链酶扩增(hda)、重组酶聚合酶扩增(rpa)和酶促重组恒温扩增技术(era)，这些技术各有特点。

3、逆转录酶促重组等温扩增(reverse transcription enzymatic recombinaseamplification，rt-era)，是中国苏州先达基因科技有限公司开发的等温扩增技术，利用来源于细菌、病毒和噬菌体的特定工具酶进行改造突变并筛选其功能，在低温条件下(25℃-42℃)可对痕量的靶dna片段进行特异性的扩增，在最适温度37℃-42℃时，扩增反应时间可在15分钟内，与日本荣研公司的lamp技术，英国twistdx公司的rpa技术，以及目前广泛使用的荧光定量pcr技术相比，其低温适应性和灵敏度等方面取得了重大突破。

4、目前，针对基孔肯雅病毒的实验室检测常用方法主要有病毒分离、血清学抗体检测、抗原检测、分子生物学检测含基因芯片、rt-pcr以及宏基因组测序等。然而，目前尚未出现利用era恒温扩增技术快速检测基孔肯雅病毒的技术手段。

技术实现思路

1、本发明的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提供一种基于era技术的基孔肯雅病毒检测用p2型成套探针引物组，以基孔肯雅病毒chikv的ns1基因保守序列作为靶基因，能用于rt-era法检测基孔肯雅病毒；本发明还提供相应试剂盒，可准确、快速、有效检测基孔肯雅病毒chikv；同时还提供相应的应用，即采用上述试剂盒的非诊断目的检测方法。

2、本发明解决其技术问题的技术方案如下：

3、一种基于era技术的基孔肯雅病毒检测用p2型成套探针引物组，其特征是，所述p2型成套探针引物组由荧光探针和引物对组成，所述引物对由正向引物和反向引物组成；所述荧光探针为chikv ns1 p2；所述引物对由正向引物f11和反向引物r11组成，或由正向引物f13和反向引物r13组成；

4、所述荧光探针chikv ns1 p2的序列为在seq id no:1中将第31位碱基标记荧光基团、将第32位碱基替换为四氢呋喃、将第33位碱基标记淬灭基团、并在3`端加入阻断基团；

5、正向引物f11的序列为seq id no:2，反向引物r11的序列为seq id no:4；正向引物f13的序列为seq id no:3，反向引物r13的序列为seq id no:5。

6、采用该p2型成套探针引物组后，即能以rt-era法检测基孔肯雅病毒chikv。

7、优选地，所述荧光基团为fam，所述淬灭基团为bhq，所述阻断基团为c3-spacer。

8、优选地，所述p2型成套探针引物组针对的靶基因是基孔肯雅病毒的ns1基因保守序列，如seq id no:6所示。

9、采用以上优选方案，能更好地实现以rt-era法检测基孔肯雅病毒chikv。

10、本发明还提供：

11、一种基于era技术的基孔肯雅病毒检测用试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括：含有前文所述p2型成套探针引物组的探针引物混合液。

12、优选地，在探针引物混合液中，p2型成套探针引物组的荧光探针、正向引物、反向引物的摩尔比为1:3.5:3.5。

13、优选地，所述试剂盒还包括rt-荧光扩增试剂、溶解剂、激活剂、超纯水、以及chikv阳性对照品。

14、优选地，所述chikv阳性对照品的制备过程如下：

15、构建含有chikv ns1基因保守序列的质粒，经体外转录反应获得ns1基因的rna片段，纯化后即得到chikv阳性对照品；所述chikv ns1基因保守序列如seq id no:6所示。

16、优选地，所述rt-荧光扩增试剂和溶解剂均由市售的基础通用型rt-era法试剂盒提供；所述激活剂为280mm乙酸镁溶液；所述chikv阳性对照品的浓度为10ng/μl。

17、采用上述试剂盒，可有效实现以rt-era法检测基孔肯雅病毒chikv。

18、本发明还提供：

19、一种非诊断目的基于era技术的基孔肯雅病毒检测方法，其特征是，采用前文所述试剂盒；所述检测方法为rt-era检测法，包括以下步骤：

20、第一步、将反应管分为样本组和阳性对照组；向各反应管中加入试剂盒的溶解剂、探针引物混合液以及超纯水，获得混合反应液；

21、第二步、将混合反应液转移至rt-荧光扩增试剂中，震荡混匀直到rt-荧光扩增试剂重悬，离心；

22、第三步、向样本组的反应管中加入待测核酸样品，混匀后离心；向阳性对照组的反应管中加入chikv阳性对照品，混匀后离心；

23、第四步、在反应管盖上加入激活剂，盖紧管盖，通过离心使激活剂进入管内液体中，震荡混匀并再次离心；

24、第五步、将反应管置于荧光恒温扩增仪中进行rt-era扩增，并采集荧光值；

25、第六步、反应结束，保存数据；根据阳性对照组的时间-荧光值曲线，判断本次检测是否有效；若本次检测有效，则根据样本组的时间-荧光值曲线，判断待测核酸样品是否含有基孔肯雅病毒。

26、优选地，第五步中，在rt-era扩增时，温度为40℃-42℃，持续5-20分钟，每30秒采集一次fam通道荧光值。

27、采用上述检测方法可顺利实现以rt-era法检测基孔肯雅病毒chikv，且能直观地在普通荧光扩增仪(常规的荧光定量pcr仪或迷你型恒温荧光仪)上判断结果，快速准确。

28、与现有技术相比，本发明针对基孔肯雅病毒chikv以rt-era法进行检测，设计筛选了专门的p2型成套探针引物组，包含p2型成套探针引物组的试剂盒，以及采用该试剂盒的检测方法。该试剂盒使用简单，易于实验操作；不需要大型复杂昂贵的仪器；结果鉴定方便直观，反应结束后无需开盖，可避免开盖导致的后续气溶胶污染假阳性问题，无需后续核酸电泳等繁琐过程；快速高效，在5分钟即可判定阳性，20分钟内即可完成扩增；检测敏感性高，经实验对比测试，该试剂盒检测chikv ns1基因的敏感性最低可检测到100拷贝。

29、本发明以基孔肯雅病毒chikv的ns1基因保守序列为目的片段构建标准质粒，建立chikv的rt-era简单、快速、准确、灵敏的检测方法，结果可靠，成本相对较低，尤其适用于现场或野外即时检测，并适用于国内大多数缺乏实时荧光定量pcr仪的医院、防疫疾控部门实验室使用，适合对海关或边境内chikv输入性病例快速初步鉴定及其流行现状筛查，对于chikv感染防控工作具有重要意义。