一种高产γ-氨基丁酸的希氏乳杆菌及其获取方法与应用与流程

本发明涉及微生物，特别涉及一种高产γ-氨基丁酸的希氏乳杆菌及其获取方法与应用。

背景技术：

1、γ－氨基丁酸，可简称为γ－氨基丁酸，又称为哌啶酸，是一种天然存在于自然界中的非蛋白质氨基酸，广泛分布于微生物、植物和动物中，在哺乳动物体内作为中枢神经系统的主要抑制性神经递质发挥着关键作用。γ-氨基丁酸经谷氨酸脱羧酶催化由谷氨酸转化而成，具有抗惊厥、舒降血压、改善睡眠、预防阿尔兹海默病以及提高人体记忆力等生理功能，被视为药物和食品中的一种生物活性成分。2009年，国家卫生部批准短乳杆菌与希氏乳杆菌发酵制备的γ-氨基丁酸为新资源食品，可用于巧克力、可可制品、糖果、饮料、膨化和焙烤食品中，在食品领域具有良好的应用前景。

2、目前γ－氨基丁酸的制备方法主要包括植物富集法、化学合成法及微生物合成法三类，相比较而言，植物富集法虽工艺简单且安全性较高，但产量低、分离难度大，难以实现规模化生产；化学合成法反应复杂且安全性差，其产物达不到食品及医药产品的标准；而微生物发酵合成法操作难度低、安全性较好且条件温和，适用于大规模生产制备，是较为理想的合成方法。

3、乳酸菌是可利用碳水化合物发酵产生乳酸的一类细菌的总称，广泛应用于食品和医疗行业，长久以来乳酸菌就作为食品级微生物使用。乳酸菌是γ－氨基丁酸发酵的理想菌株，通常情况下，酸菜、酸奶和奶酪等发酵食品中中存在大量乳酸菌。现有报道中，菌株产γ-氨基丁酸的产量较低，酶活性较弱，转化率较低。

4、因此，提供一种高产γ－氨基丁酸的乳杆菌及其应用，对于工业制备γ-氨基丁酸具有重大意义。

技术实现思路

1、本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种发酵周期短、生产安全系数高、生产成本低的高产γ-氨基丁酸的希氏乳杆菌及其获取方法与应用。

2、本发明是通过如下技术方案实现的：

3、一种高产γ-氨基丁酸的希氏乳杆菌，其特征在于：所述希氏乳杆菌命名为lactobacillus hilgardii xgsc-γ-s26，其从市购酸菜汁中分离、纯化、诱变得到，该希氏乳杆菌于2023年02月21日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno.26645。

4、本发明的希氏乳杆菌的γ-氨基丁酸合成能力较强，发酵周期较短，生产安全系数高，可有效解决当前γ-氨基丁酸生产过程中产酸水平低、发酵周期长的问题，对提升产品产量、降低生产成本具有重要意义。

5、上述高产γ-氨基丁酸的希氏乳杆菌的获取方法，包括如下步骤：

6、（1）将市购的酸菜研磨后，取研磨液接种于mrs培养基中，振荡混匀活化；

7、（2）取活化液均匀涂布于含有质量分数为0.3%的碳酸钙的固体mrs培养基上培养，挑选生长状况较好的单菌落，在固体mrs培养基上不断划线进而得到纯化菌株；对该纯化菌株进行形态观察及染色鉴定；

8、（3）对纯化菌株接种于种子培养基中培养，之后将其接种于发酵培养基中，恒温条件下发酵，取发酵上清液经薄层层析定性分析及比色法定量测定后确定产γ-氨基丁酸的菌株；

9、（4）将选择出来的菌株接种于发酵培养基中进行活化培养，培养至对数期后取出发酵液，离心取沉淀，之后经洗涤后加生理盐水混匀得到菌悬液，将菌悬液放置于培养皿中，黑暗条件下进行紫外诱变；

10、（5）将紫外诱变后的菌液稀释，之后在含有0.3%碳酸钙的mrs平板上培养，挑选溶钙圈大、形态较大的菌落于种子培养基中活化培养，之后接种于发酵培养基中发酵，hplc测定其发酵上清液中γ-氨基丁酸含量，γ-氨基丁酸含量最高的即为目标菌株。

11、本发明的更优技术方案为：

12、步骤（1）中，取1ml研磨液接种于5mlmrsa培养基中，活化时间为16-30h，温度为26-33℃，优选30℃。

13、步骤（2）中，取500μl活化液均匀涂布于固体mrs培养基上培养，培养时间为20-36h；得到的纯化菌株为清晰可见、分离明显的单菌落。

14、步骤（3）中，将纯化菌株接种于5ml种子培养基种培养12-26h，再按3%的接种量将其接种于25ml的发酵培养基中，恒温条件下发酵3天，发酵液在10000rpm下离心10min得到发酵上清液。

15、进一步优选的技术方案为，该步骤中比色法为改良后的berthelot比色法，主要步骤为：取0.5ml待测样品，加入ph为9.0、浓度为0.2mol/l的硼酸缓冲液0.2ml，质量分数为6%的苯酚溶液1ml和质量分数为7%的次氯酸钠溶液0.4ml，充分振荡后沸水浴加热10min，之后迅速在冰水浴中冷却10min，待出现蓝绿色后再加入体积分数60%的乙醇溶液2ml，以γ－氨基丁酸标准溶液为空白对照组，在波长为630nm处测定吸光度（od），根据标准溶液中γ－氨基丁酸含量对标样品中的γ－氨基丁酸含量。

16、步骤（4）中，将选择出来的菌株按体积比3%的接种量接种于25ml发酵培养基中；发酵液于10000rpm下离心10min后取沉淀，用10ml生理盐水洗涤两次，再加入10ml生理盐水混匀得到菌悬液，将菌悬液放置于培养皿中，置于黑暗条件下，再距离30w紫外灯30cm出照射致死率为80-90%的时间。

17、步骤（5）中，将紫外诱变后的菌液稀释至10-7、10-8，之后在含有0.3%碳酸钙的mrs平板上培养，挑选的菌落于25ml种子培养基中活化培养，再按10%的接种量接种于100ml发酵培养基中发酵60-80h，发酵至稳定器后，将发酵液的ph调整到4.0-5.0并保持该ph，以便菌株更好合成γ-氨基丁酸。

18、进一步优选的技术方案为，步骤（3）-（5）中，种子培养基配方为：葡萄糖30-50g/l、硫酸铵7-9g/l、蛋白胨8-12g/l、酵母浸粉18-26g/l、磷酸二氢钾5-7g/l、硫酸镁0.5-1.5g/l、硫酸锰0.005-0.015g/l、硫酸亚铁0.005-0.015g/l、5-磷酸吡哆醛0.02-0.10mmol/l；

19、发酵培养基配方为：l-谷氨酸钠25-40g/l、葡萄糖20-45g/l、硫酸铵15-30g/l、蛋白胨9-15g/l、酵母浸粉6-7g/l、磷酸二氢钾0.5-1.0g/l、硫酸镁1.5-4g/l、生物素60-80μg/l、硫酸锰0.005-0.015g/l、硫酸亚铁0.005-0.015g/l、5-磷酸吡哆醛0.8-1.6mmol/l。

20、上述希氏乳杆菌在制备γ-氨基丁酸中的应用，其特征在于：所述希氏乳杆菌发酵培养结束后，采用hplc法测定其发酵上清液中γ-氨基丁酸含量，其含量最高达到13.48g/l，发酵上清液净脱色过滤、蒸发浓缩、结晶、干燥后，制得纯度＞98%的晶体γ-氨基丁酸产品。

21、进一步优选的技术方案为，向发酵上清液中加入占其体积3%的活性炭进行煮沸脱色，然后使用0.22μm的滤膜进行过滤；

22、滤液在真空度0.08-0.12mpa、温度60-75℃下蒸发浓缩，至有结晶物析出且浓缩液呈现稀糊状态时停止浓缩；

23、之后采用分段降温结晶，现将浓缩液冷却至24℃，过滤出析出晶体作为晶种；

24、再向剩余溶液中加入溶液体积2.5-3倍体积的无水乙醇，加入晶种，以30-50r/min搅拌，并以2-3℃/min的速率降温；

25、对降温后溶液过滤，在80-85℃下干燥，得到纯度＞98%的晶体γ-氨基丁酸产品。

26、本发明具有以下有益技术效果：

27、（1）本发明从传统发酵产品酸菜中分离筛选出一种高产γ-氨基丁酸的希氏乳杆菌（lactobacillus hilgardii）xgsc-γ-s26，经紫外诱变后，其发酵上清液液中的γ-氨基丁酸含量可达到13.48g/l，是出发菌株产酶酶活的2.16倍，有效提高了γ-氨基丁酸的产量；

28、（2）本发明的培养方法操作难度低、安全性较好且条件温和，能够使得希氏乳杆菌充分活化，发酵过程中od600nm最高可达到9.86，充分保证其发酵效果，适用于大规模生产制备；

29、（3）本发明利用该高产γ-氨基丁酸的希氏乳杆菌进行发酵，菌体充分生长后利用l-谷氨酸钠生成γ-氨基丁酸，再经过脱色过滤、蒸发浓缩、结晶、干燥后，可制得纯度＞90%的晶体γ－氨基丁酸产品。本发明用廉价的l-谷氨酸钠原料替代一般发酵过程中常用的l-谷氨酸，有效节省了生产成本，菌体培养发酵时间较短，有效缩短了生产周期。