一种稳定的醛缩酶测定试剂盒及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生化检测，特别是涉及一种稳定的醛缩酶测定试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术：

1、醛缩酶(aldolase)是一种可以裂解羟醛的酶，有三个不同亚型，分别为aldolasea(aldoa)、aldolase b(aldob)和aldolase c(aldoc)，其基因染色体定位分别为17q11.2、9q31.1和17q11.2。醛缩酶家族成员在人体组织中的表达具有特异性。研究发现，发育中的胚胎组织及成年人肌肉组织中主要表达aldoa；成年人肝脏、肾脏组织中多表达aldob；在大脑及其他神经组织中，aldoc的表达则更为丰富。醛缩酶家族主要在糖酵解过程中发挥重要作用，在以葡萄糖为底物的糖酵解过程中，醛缩酶家族参与催化1,6-二磷酸果糖(fructose-1,6-diphosphate,fdp)生成磷酸二羟丙酮(dihydroxyacetone phosphate，dhap)和3-磷酸甘油醛(3-phosphoglyceraldehyde，g3p)。

2、血清醛缩酶测定有助于诊断肌肉和肝脏疾病。(1)肌肉疾病：肌营养不良症、多发性肌炎等患者血清醛缩酶活性升高。在肌营养不良症中，以假肥大型、肢带型和远端型的酶活性最高，肩肱型和眼肌型仅轻度升高或正常。通常，醛缩酶活性随年龄增加而递减，在活动期和肌肉萎缩之前酶活力增高最显著，故其测定有助于本病的诊断。心肌梗死患者血清醛缩酶活力升高，一般在胸痛发作24～48h达高峰，其变化规律与ast相同，但比ast改变要早，心绞痛时则正常。(2)肝脏疾病：急性病毒性肝炎醛缩酶活性的升降与alt相平行。慢性肝炎、肝硬化、阻塞性黄疸仅轻度升高。

3、另有研究发现，醛缩酶家族成员在恶性肿瘤中的异常表达已被证实与肿瘤患者预后密切相关。aldoa在胃癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、乳腺癌、口腔鳞状上皮细胞癌和甲状腺癌等多种肿瘤组织中均呈现高表达，并可作为一个独立的预后因素，提示患者的不良预后结局。

4、常用的血清醛缩酶活性测定有比色法、酶偶联法、酶联免疫吸附实验法(elisa)，手动比色法操作复杂，容易出现误差；酶联免疫吸附实验法(elisa)目前在临床应用广泛，技术成熟，虽然在灵敏度、特异性、试剂价格等方面占有优势，但该技术在检测时间、操作性等方面存在弊端。酶偶联法主要为3-磷酸甘油脱氢酶偶联法，醛缩酶催化1,6-二磷酸果糖生成磷酸二羟丙酮和3-磷酸甘油醛，在nadh存在下磷酸二羟丙酮还原成1,3-二磷酸甘油，于波长340nm监测吸光度下降速率，但是酶偶联法容易受到丙酮酸的干扰，nadh在液体溶液中非常不稳定，容易被氧化成nad+。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供一种稳定的醛缩酶测定试剂盒，该试剂盒是稳定性强、准确度高、抗干扰性强的液体试剂盒。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一种稳定的醛缩酶测定试剂盒由以下成分组成，试剂盒含有试剂r1和试剂r2；

4、试剂r1包含以下组分：

5、

6、试剂r2包含以下组分：

7、

8、优选地，试剂r1的ph值为8.0-10.0；试剂r2的ph值为7.0-9.0。

9、优选地，试剂r1中所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、磷酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、甘氨酸缓冲液中的任一种；试剂r2中所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、磷酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、甘氨酸缓冲液中的任一种。

10、优选地，试剂r1中所述的稳定剂由甘露寡糖、牛血清白蛋白和表面活性剂四聚乙二醇单月桂醚组成，且质量比为2-4:3:3-4。

11、优选地，试剂r2中所述的酶激活剂为znso4·7h2o、zncl2的任一种。

12、优选地，试剂r2中所述的稳定剂为酪蛋白酸钠。

13、优选地，所述试剂r1与试剂r2的体积比为1～5:1，更优选地，所述试剂r1与试剂r2的体积比为4:1。

14、上述所述的醛缩酶测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

15、(1)试剂r1的配制：取适量水，分别加入r1中的缓冲液、甲酸、1,6-二磷酸果糖(fdp)、稳定剂、叠氮钠，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，用盐酸或氢氧化钠调节到ph值8.0-10.0，再加入磷酸丙糖异构酶、nadh、乳酸脱氢酶、甲酸脱氢酶，搅拌溶解后定容到所需体积；

16、(2)试剂r2的配制：取适量水，分别加入r2中缓冲液、稳定剂、酶激活剂、proclin300，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，用盐酸或氢氧化钠调节到ph值7.0-9.0，再加入3-磷酸甘油脱氢酶，搅拌溶解后定容到所需体积。

17、上述所述的醛缩酶测定试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中醛缩酶的浓度。

18、本发明醛缩酶测定试剂盒原理为醛缩酶通过分解1,6-二磷酸果糖为磷酸二羟丙酮和3-磷酸-d-甘油醛，3-磷酸-d-甘油醛在磷酸丙糖异构酶的作用下转化为磷酸二羟丙酮，在nadh存在下3-磷酸甘油脱氢酶将磷酸二羟丙酮还原成1,3-二磷酸甘油，于波长340nm监测nadh吸光度下降速率。

19、本发明检验原理如下：

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21、

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23、本发明的有益效果：

24、1、本发明稳定的醛缩酶测定试剂盒为液体双试剂，无需复溶配制，开瓶可以直接使用。

25、2、本发明采用nadh辅酶再生，甲酸脱氢酶催化甲酸和nad+生成co2和nadh，甲酸和co2对r1中磷酸丙糖异构酶和乳酸脱氢酶的活性没有影响，有利于提高试剂的稳定性和准确度。

26、3、本发明试剂r1中添加稳定剂甘露寡糖、牛血清白蛋白和表面活性剂四聚乙二醇单月桂醚，且质量比为2-4:3:3-4，有利于保护r1中磷酸丙糖异构酶、乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶，提高试剂r1的稳定性，表面活性剂四聚乙二醇单月桂醚还有利于消除乳糜干扰。

27、4、本发明试剂r2中添加稳定剂酪蛋白酸钠，保护3-磷酸甘油脱氢酶，显著提高试剂r2的稳定性。

28、5、本发明制备的醛缩酶测定试剂稳定性好、准确度高、线性范围广、抗干扰性强，37℃可保存10天，明显优于市售的同类型产品。

技术特征：

1.一种稳定的醛缩酶测定试剂盒，其特征在于，由以下成分组成，试剂盒含有试剂r1和试剂r2；

2.根据权利要求1所述的一种稳定的醛缩酶测定试剂盒，其特征在于，试剂r1的ph值为8.0-10.0；试剂r2的ph值为7.0-9.0。

3.根据权利要求1所述的一种稳定的醛缩酶测定试剂盒，其特征在于，试剂r1中所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、磷酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种；试剂r2中所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、磷酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种。

4.根据权利要求1所述的一种稳定的醛缩酶测定试剂盒，其特征在于，试剂r1中所述的稳定剂由甘露寡糖、牛血清白蛋白和表面活性剂四聚乙二醇单月桂醚组成，且质量比为2-4:3:3-4。

5.根据权利要求1所述的一种稳定的醛缩酶测定试剂盒，其特征在于，试剂r2中所述的酶激活剂为znso4·7h2o、zncl2的任一种。

6.根据权利要求1所述的一种稳定的醛缩酶测定试剂盒，其特征在于，试剂r2中所述的稳定剂为酪蛋白酸钠。

7.根据权利要求1所述的一种稳定的醛缩酶测定试剂盒，其特征在于，所述试剂r1与试剂r2的体积比为1～5:1，更优选地，所述试剂r1与试剂r2的体积比为4:1。

8.一种权利要求1-7任一项所述的一种稳定的醛缩酶测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.一种权利要求1-7任一项所述的一种稳定的醛缩酶测定试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中醛缩酶的浓度。

技术总结
本发明公开了一种稳定的醛缩酶测定试剂盒，由以下成分组成，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；试剂R1包含以下组分：缓冲液、NADH、1,6‑二磷酸果糖、磷酸丙糖异构酶、乳酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、甲酸、稳定剂、叠氮钠；试剂R2包含以下组分：缓冲液、3‑磷酸甘油脱氢酶、稳定剂、酶激活剂、Proclin 300。该试剂盒是稳定性强、准确度高、抗干扰性强的液体试剂盒。同时还公开了该试剂盒的制备方法和应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中醛缩酶的浓度。

技术研发人员：王飞,刘明霞,隗勇
受保护的技术使用者：中拓生物有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14