一种能识别肠道病毒A种群病毒结构蛋白VP1的广谱单克隆抗体及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域和免疫分析，具体涉及一种能识别肠道病毒a种群病毒结构蛋白vp1的广谱单克隆抗体及其应用。

背景技术：

1、随着手足口病(hand-foot-mouth disease,hfmd)在亚太地区持续地区域性爆发，对引起手足口病的肠道病毒的研究越来越受到人们的重视。其中，单克隆抗体在肠道病毒的基础研究、疫苗研发、体外诊断和抗病毒药物开发等方面有着非常重要的作用。肠道病毒属于小rna病毒科肠道病毒属。肠道病毒属包括肠道病毒a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k和l十二个种群以及鼻病毒a、b和c三个种群。其中，肠道病毒a种群病毒是引起婴幼儿手足口病的主要病原体，其次是肠道病毒b种群病毒。肠道病毒a种群包括25种血清型：柯萨奇病毒a组2型(coxsackievirus a2,cv-a2)、cv-a3、cv-a4、cv-a5、cv-a6、cv-a7、cv-a8、cv-a10、cv-a12、cv-a14、cv-a16，肠道病毒a组71型(enterovirus a71,ev-a71)、ev-a76、ev-a89、ev-a90、ev-a91、ev-a92、ev-a114、ev-a119、ev-a120、ev-a121，猿肠道病毒(simianenteroviruses)sv19、sv43、sv46和狒肠道病毒(baboon enterovirus)ba13。

2、在肠道病毒预防方面，国内已有多家eva71疫苗产品上市，并随着疫苗的接种率不断上升，国内报道的ev-a71引起的手足口病病例呈明显下降趋势。但与此同时，国内外相继出现了其他新的可以导致婴幼儿手足口病的肠道病毒血清型流行。这些血清型包括肠道病毒a种群的cv-a16、cv-a6、cv-a10、cv-a5、cv-a4和cv-a2，肠道病毒b种群的echo6、echo11、echo18、echo30，cvb1～b5等。近几年的流行病学调查显示cv-a16、cv-a6和cv-a10是引起我国婴幼儿手足口病的主要血清型，并呈现多种血清型共感染的情况。

3、此前报道的肠道病毒广谱单克隆抗体文献较少，《derivation and biochemicalcharacterization of an enterovirus group-specific monoclonal antibody》(geyousef,et al.intervirology,1987,28(3):163-170)中公开了广谱单克隆抗体5-d8/1可同时识别柯萨奇病毒a和b组、脊髓灰质炎病毒和艾柯病毒，识别表位位于结构蛋白vp1。《identification of specific and shared epitopes at the extreme n-terminal vp1of coxsackievirus a4,a2 and a5 by monoclonal antibodies》(yx tian,et al.virusresearch,2023,328:199074)中公开了通过cv-a4免疫小鼠获得的单克隆抗体可以广谱识别cv-a2、cv-a4和cv-a5，识别表位位于结构蛋白vp1的n末端。总之，随着多种肠道病毒血清型的流行，筛选和鉴定针对肠道病毒的广谱单克隆抗体在肠道病毒的基础研究、疫苗研发、体外诊断和抗病毒药物开发等方面有着非常重要的作用。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明的第一个目的是提供一种能识别肠道病毒a种群病毒结构蛋白vp1的广谱单克隆抗体。该单克隆抗体为igg1亚型非中和抗体，可广谱识别肠道病毒a种群病毒的结构蛋白vp1，命名为1h4。

2、具体地，该单克隆抗体包含以下六个互补决定区(complementarity determiningregion,cdr)：

3、(1)重链的互补决定区vhcdr1的氨基酸序列如seq id no.1所示；

4、(2)重链的互补决定区vhcdr2的氨基酸序列如seq id no.2所示；

5、(3)重链的互补决定区vhcdr3的氨基酸序列如seq id no.3所示；

6、(4)轻链的互补决定区vlcdr1的氨基酸序列如seq id no.4所示；

7、(5)轻链的互补决定区vlcdr2的氨基酸序列如seq id no.5所示；

8、(6)轻链的互补决定区vlcdr3的氨基酸序列如seq id no.6所示。

9、所述单克隆抗体为igg1型抗体，具有结合活性，没有中和活性；能广谱识别肠道病毒a种群病毒。具体地，所述单克隆抗体能识别肠道病毒a种群病毒的结构蛋白vp1，其可结合的线性表位的氨基酸序列如seq id no.11所示。

10、在优选的实施方案中，所述肠道病毒a种群病毒包括cv-a2、cv-a3、cv-a4、cv-a5、cv-a6、cv-a7、cv-a8、cv-a10、cv-a12、cv-a14、cv-a16，ev-a71、ev-a76、ev-a89、ev-a90、ev-a91、ev-a92、ev-a114、ev-a119、ev-a120、ev-a121，sv19、sv43、sv46，ba13。

11、在进一步优选的实施方案中，所述肠道病毒a种群病毒包括cv-a2、cv-a4、cv-a5、cv-a6、cv-a10、cv-a16、ev-a71。

12、在优选的实施方案中，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq idno.7所示；或所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为与seq id no.7所示的序列具有95％以上同源性的序列(例如，将seq id no.7所示的氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸后所形成的具有同等功能的序列)。

13、在优选的实施方案中，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq idno.8所示；或所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列为与seq id no.8所示的序列具有95％以上同源性的序列(例如，将seq id no.8所示的氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸后所形成的具有同等功能的序列)。

14、在进一步优选的实施方案中，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如seqid no.7所示，且所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.8所示。

15、本发明的第二个目的是提供编码所述单克隆抗体的核苷酸片段。

16、在优选的实施方案中，所述核苷酸片段包含如seq id no.9所示的重链可变区的核苷酸序列。

17、在优选的实施方案中，所述核苷酸片段包含如seq id no.10所示的轻链可变区的核苷酸序列。

18、在进一步优选的实施方案中，所述核苷酸片段包含如seq id no.9所示和如seqid no.10所示的核苷酸序列，如seq id no.9所示的核苷酸序列编码所述单克隆抗体的重链可变区，如seq id no.10所示的核苷酸序列编码所述单克隆抗体的轻链可变区。

19、本发明第三个目的是提供可以在受体细胞内表达具有所述单克隆抗体功能的蛋白的重组载体，所述重组载体中含有所述核苷酸片段。

20、本发明第四个目的是提供可以稳定表达具有所述单克隆抗体功能的蛋白的工程细胞系，所述工程细胞系包含所述重组载体，或者所述工程细胞系的基因组中整合有所述核苷酸片段。

21、本发明第五个目的是提供一种抗体偶联物，所述抗体偶联物包含抗体部分和偶联部分；所述抗体部分为所述单克隆抗体，所述偶联部分选自可检测标记物、药物、病毒外壳蛋白或病毒样颗粒中至少一种。

22、本发明提供的所述单克隆抗体、所述重组载体、所述工程细胞系、所述抗体偶联物可用于制备检测、抑制、预防或/和治疗肠道病毒a种群病毒的产品。

23、与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的单克隆抗体可以广谱结合肠道病毒a种群病毒，而不结合肠道病毒a种群病毒以外的其他肠道病毒属病毒。该单克隆抗体可以进行免疫印迹(western blot,wb)、间接免疫荧光试验(indirectimmunofluorescence assay,iifa)及酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbentassay，elisa)等基础实验。该单克隆抗体对引起婴幼儿手足口病的主要肠道病毒a种群病毒都具有结合活性。该抗体在肠道病毒a种群病毒的检测和抗病毒产品的开发等方面都具有重要研究和应用价值。