一种碱性耐高温魔芋葡甘聚糖降解酶及其制备方法

本发明属于葡甘聚糖降解，具体涉及一种碱性耐高温魔芋葡甘聚糖降解酶及其制备方法。

背景技术：

1、魔芋(amorphophallus albus)又名“蒟篛”，是天南星科(araceae)魔芋属(amorphophallus blume)多年生宿根草本植物，地下茎呈球茎状，叶片呈伞状，是亚洲常见的食物来源和传统药物。中国是魔芋的主要生产国之一，随着市场对魔芋粉的需求量越来越大，我国每年的魔芋产量都在不断增加。魔芋较其它植物资源，富含独特营养成分葡甘聚糖，经脱水烘干的魔芋片，其葡甘聚糖含量高达50％以上。魔芋葡甘聚糖(konjacglucomannan，kgm)是一种从魔芋中分离的中性杂多糖，是魔芋的主要活性成分，由d-葡萄糖与d-甘露糖以1:1.5～1:1.6的比率由β-1,4糖苷键连接而成。魔芋葡甘聚糖对人体有很好的保健功能，是一种重要的膳食纤维，可用作“瘦身”食品。但是天然的大分子魔芋葡甘聚糖粘度大，吸水膨胀率高，直接食用难以下咽，自身带有异味，加工魔芋豆腐等凝胶食品时须用碱液处理，这些大大限制了魔芋葡甘聚糖利用和食用。魔芋葡甘低聚糖(kgmoligosaccharides，kgos)是kgm非彻底降解的产物，由葡萄糖(glucose，g)和甘露糖(mannose，m)构成，属于功能性低聚糖。相比于kgm，kgos的粘度显著降低，具有更高的水溶性、热量低、性能稳定，更有利于食品加工。此外，kgos还具有优异的益生元功能，对改善肠道微生物结构有促进作用，可广泛应用于食品与保健品。

2、近年来大量研究表明，魔芋葡甘聚糖经化学或生物水解方法可获得大量魔芋葡甘低聚糖，常用于魔芋葡甘聚糖降解的酶有纤维素酶、β-甘露糖酶和葡聚糖酶，不同种类的酶对魔芋葡甘聚糖的降解条件和效果不同。纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称，纤维素酶的组成比较复杂，一般作用温度为40～50℃，最终分解产物为葡萄糖；β-甘露糖酶是一种酶类蛋白质，能够催化β-甘露糖苷的水解反应，作用温度为45～55℃，能将β-甘露糖苷分解成葡萄糖和甘露糖；葡聚糖酶是一种能够降解葡聚糖的酶类蛋白质，作用温度为50～55℃，能将葡聚糖水解成葡萄糖单元。以上三种酶系也存在着一些缺点：首先，它们的最佳降解温度较低，不利于工厂在适宜温度下进行酶解反应；其次，它们只能获得葡萄糖单糖单元，无法获得葡甘露低聚糖，降低了生理功能；最后，它们的酶效率较低，需要较长时间才能完成降解反应。

技术实现思路

1、为了解决以上问题，本发明提供了一种耐高温且水解效果明显的魔芋葡甘聚糖降解酶及其制备方法。该酶的最佳降解温度较高，可在高温条件下进行酶解反应，提高了反应效率，以便于魔芋高温加工，在魔芋葡甘聚糖降解的同时去除魔芋中的生物碱等有害物质；该酶能够在碱性条件下进行酶解反应，扩大了反应条件范围，提高了反应效率和速度；该酶能够将魔芋葡甘聚糖降解为2～14分子量的寡糖单元，提高了其生理活性功能和原料利用率。

2、针对上述目的，本发明采用的魔芋葡甘聚糖降解酶由下述方法制备得到：

3、步骤1：菌种获取

4、取已被微生物水解为液体的魔芋豆腐，离心，取沉淀于无菌生理盐水中震荡均匀，过5～20μm滤纸，获得混合菌液；将混合菌液均匀涂布在基础培养基上，在30～45℃培养至有肉眼可见的菌落；观察基础培养基菌落形态，分别将不同形态的菌体再转接于基础培养基上，平板划线、纯化培养。在30～45℃培养至平板上有肉眼可见的菌落；重复平板划线、纯化培养3～5次，至所分离到的菌株为单一菌落，分别将所述菌株再转接于种子培养基上，30～45℃培养24～36h，选取培养基由透明半固态变为淡黄色液体状态、无明显魔芋气味的纯化菌株，即为嗜碱芽孢杆菌，4℃保存。

5、步骤2：菌种活化

6、将4℃保存的嗜碱芽孢杆菌转接到接种于种子培养基中，于30～45℃摇床培养24～36h，得到活化后的嗜碱芽孢杆菌种子液。

7、步骤3：菌悬液制备

8、取步骤2活化后的嗜碱芽孢杆菌种子液，离心，无菌水清洗，将沉淀转接于扩大培养基中，接种量为5％～15％，于30～45℃摇床培养24～36h；然后将扩大培养后的菌液置于高速离心机离心，用生理盐水洗涤、离心活菌体；最后将收集的菌体用无菌生理盐水稀释至107～109cfu/ml，得到菌悬液，于4℃保存。

9、步骤4：酶的提取

10、将菌悬液进行冻融和超声处理后，离心，收集上清液即为粗酶液；所述冻融的操作为：将菌悬液在-30～-10℃下冷冻，每4h取出，待溶液中心温度恢复至室温后，继续冷冻，反复4～8次；超声处理条件为：5号变幅杆，功率比50％～70％，运行时间10～20min，每超声开30s，关30s，运行温度10～30℃。

11、步骤5：酶的浓缩和干燥

12、将粗酶液置于超高速离心机中离心，取上清液，在-0.08～-0.09pa、50～80℃真空热风干燥，得到魔芋葡甘聚糖降解酶。

13、上述步骤1中，所述已被微生物水解为液体的魔芋豆腐的生产过程为：将制备好的固态魔芋豆腐装入塑料袋中，添加ph 11的ca(oh)2悬浊液浸没，密封包装，经85℃、30min湿热杀菌，常温储存3～5d后获得已被微生物水解为液体的魔芋豆腐。

14、上述步骤1中，所述基础培养基是将20.0g葡萄糖、10.0g蛋白胨、2.0g nano3、0.5gmgso4·7h2o、1.5g kh2po4、15.0g琼脂加入1000ml蒸馏水中混合均匀后，用naco3调ph至9.0±0.2，121℃灭菌20min获得。

15、上述步骤2中，所述种子培养基是将10～20g葡甘聚糖、4～9g胰蛋白胨、5～12g氯化钠加入1000ml蒸馏水中混合均匀后，用naco3调ph至9.0±0.2，121℃灭菌20min获得；所述扩大培养基是将15～30g葡甘聚糖、7～15g胰蛋白胨、5～12g氯化钠加入1000ml蒸馏水中混合均匀后，用naco3调ph至9.0±0.2，121℃灭菌20min获得。

16、上述步骤3中，优选接种量为10％。

17、上述步骤4中，优选冻融操作为：将菌悬液在-20±2℃下冷冻，每4h取出，待溶液中心温度恢复至室温后，继续冷冻，反复6次。

18、上述步骤4中，优选超声处理条件为：5号变幅杆，功率比60％，运行时间10min，每超声开30s，关30s，运行温度20℃。

19、本发明的有益效果如下：

20、本发明从已被微生物水解为液体的魔芋豆腐中分离得到一株在强碱性条件下耐85℃芽孢细菌，该菌对魔芋葡甘聚糖有很好的水解作用；将该菌扩大培养后，收集细胞，再经过细胞破碎等工艺制成葡甘聚糖降解酶。本发明得到的葡甘聚糖降解酶耐高温，以此酶进行魔芋葡甘聚糖的水解，水解效果明显，在65℃保温4h时仍具有80％以上活力，降解产物为2～14个分子的寡糖，能够维护肠道健康、调节血糖和胆固醇水平、促进免疫系统功能等。在实际加工中，高温处理便于在降解魔芋的同时去除魔芋中的生物碱等有害物质，去除魔芋本身的腥味，增加魔芋浆的营养价值。高温降解处理对于发挥魔芋的功能作用，增大人体一次性对魔芋的食用量、脱除魔芋异味都具有一定的实践意义，有望开发出高效快速的葡甘聚糖水解酶食品添加剂，为魔芋产业的开发和利用做出更大的贡献。