一种模拟免疫缺陷病单碱基基因编辑非人灵长类动物模型及其制作方法与应用

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种模拟免疫缺陷病单碱基基因编辑非人灵长类动物模型及其制作方法与应用。

背景技术：

1、免疫缺陷动物(immunodeficiency animals)是指免疫系统某一种或多种免疫成分缺陷的动物，是现代医学研究的重要工具，被广泛应用于免疫学、肿瘤学、器官异体移植、干细胞治疗、传染病以及寄生虫学等各个研究领域。免疫缺陷动物分为自发免疫缺陷动物(先天性免疫缺陷动物)和获得性免疫缺陷动物(诱发性免疫缺陷动物)，前者是指动物自身引起的免疫缺陷疾病或者通过定向培育得到的免疫功能不足或者免疫功能缺陷的动物；后者是由于后天的刺激，如药物刺激、病毒感染、营养不良、恶性肿瘤等使其免疫功能缺陷或这么免疫力低下的动物，如免疫抑制、aids模型等。按免疫缺陷种类分为t细胞功能缺失、b细胞功能缺失、nk细胞功能缺失型以及联合免疫缺失型。重症联合免疫缺陷病(servercombined immune deficiency disease,scid)是一组遗传性免疫缺陷病，可导致免疫系统严重功能障碍。scid的总体患病率估计为十万分之1/2。患者常有早期临床表现，如严重感染和异型增生，包括肺炎、中耳炎、皮肤感染或播散性卡介苗感染。有些患者可能缺乏典型症状，未出生时患有scid的婴儿在出生后的最初几周看起来很健康，然而随着环境暴露于病原体和母系转移抗体的减少，它们很容易发展为危及生命的细菌、病毒和/或真菌感染。如果没有早期干预来重建他们的免疫系统，患者通常无法存活到生命的前两年。scid的一个典型临床特征是血液和淋巴组织中没有t淋巴细胞。scid分为有或没有b淋巴细胞的两大类。大约23％-30％的scid患者存在可检测到一定水平的自然杀伤(nk)细胞，但没有b和t淋巴细胞。

2、目前，免疫缺陷中小动物模型由于其繁殖周期短、繁殖能力强、数量多、易于饲养、基因组信息完善易于疾病的研究、基因修饰技术也比较完善和成熟等优势，具有及其广泛的应用。常见的免疫缺陷小鼠模型的种类比较多，如scid小鼠、nod/scid小鼠、裸小鼠、xid小鼠、beige小鼠、bnx小鼠等。另外，人源化小鼠模型的出现是由纯合prkdcscid突变(其中scid代表严重联合免疫缺陷)或rag1/rag2缺陷纯合免疫缺陷株的发展推动的(由于编码抗体和t细胞受体基因的重组缺陷，所有这些都消除了宿主适应性免疫)。同时破坏il2rg基因座以降低宿主先天免疫。结合这些改变的严重免疫缺陷小鼠支持人体免疫系统成分的有效植入以及患者来源的异种移植物和细胞系来源的异种移植物的生长。目前可用的人源化小鼠模型是用于人类免疫肿瘤学研究的有前途的创新平台。许多研究人员已经使用这些模型来研究人类肿瘤与免疫系统之间的相互作用，并评估免疫疗法的疗效。随着一系列基因编辑技术的出现和成熟，免疫缺陷大鼠模型的研究进展飞速。现有的免疫缺陷大鼠品系包括nude、x-scid、rag1-ko、sdr rag2、scid、fsg、nsgl、nsgl、srg和rrgs。免疫缺陷大鼠模型的研究为临床前研究提供有力的实验工具。另外，2013年的研究报道首次通过胚胎微注射talens mrna成功获得了rag-ko的免疫缺陷兔。随后，song等人使用crispr-cas9技术生产了foxn1突变裸兔(nurabbits)，foxn1基因的功能丧失突变导致裸体重症联合免疫缺陷。总之，利用这些免疫缺陷动物模型，不仅仅在细胞水平和分子水平阐明了造血系统和免疫系统的发生和调节的关键问题，而且在病毒学、再生医学、血液病学、癌症研究、免疫学以及包括免疫缺陷在内的各种其他人类疾病研究中提供了独特的应用。尽管小鼠模型已经为我们提供了大量现代免疫系统的信息，但在有关遗传异质性或微生物影响方面仍存在明显的局限性，且作为人类疾病或疫苗接种结果的模型，也不具备预测价值。许多小鼠转化模型在自身免疫、肿瘤免疫等方面的失败已在多年前被注意到。人类和小鼠共享许多对人类功能很重要的基因和细胞类型，比如t细胞受体和免疫球蛋白基因中相同类型的v、d和j基因片段，许多相同或相似的细胞因子受体、tlr和mhc分子等，但一个众所周知的例外是hla分子仅在激活的人类t细胞表达，而在小鼠中是看不到的。翻译后修饰也可能存在重大差异，但这更难全面评估。另外，人和小鼠之间与免疫系统相关的组织和器官的结构表明存在功能差异，例如皮肤、脾脏和胸腺，例如，人类皮肤比小鼠皮肤厚得多，有5-10个细胞层，而小鼠只有2-3个细胞层。此外，人类cds、中性粒细胞和嗜碱性粒细胞中的大量独特基因，可能与在小鼠对涉及这些细胞的过敏反应和其他人类病理进行建模是遇到困难有关。简单来说，cds在收集抗原并将其呈递给t细胞方面发挥着关键作用，并且长期以来一直被认为在人类和小鼠之间存在一定的差异，但究竟如何以及可能产生什么后果尚不清楚。例如，在人类中，tlrs7和9主要在浆细胞样的cds中表达，而在小鼠中，tlrs7和9在其他dcs亚群上更广泛地表达。

3、非人类灵长类动物常被认为与人类有很大的系统发育关系，并且在生理上有许多相似之处，例如高度相似的免疫系统。非人类灵长类动物(nhps)与人类在遗传和生理上的相似性使得它们成为生物医学研究的绝佳模型。然而，目前尚缺乏转基因免疫缺陷模型，建立非人类灵长类动物免疫缺陷模型迫在眉睫。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于提供一种模拟免疫缺陷病单碱基基因编辑非人灵长类动物模型及其制作方法与应用，以克服现有技术中的不足。

2、为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

3、根据本发明实施例的第一方面，提供了一种模拟免疫缺陷病单碱基基因编辑非人灵长类动物模型的制作方法，包括：

4、s1、构建第一grna和第二grna，所述第一grna特异靶向非人灵长类动物的rag1基因，所述第二grna特异靶向非人灵长类动物的il2rg基因；

5、s2、将第一grna和第二grna构建到质粒上，得到重组质粒，将重组质粒体外转录合成mrna，对非人灵长类动物受精卵注入合成的mrna，以敲除rag1基因和il2rg基因，获得所述模拟免疫缺陷病单碱基基因编辑非人灵长类动物模型。

6、进一步的，所述第一grna的序列如seq id no.1所示，所述第二grna的序列如seqid no.2所示。

7、进一步的，所述步骤s2包括在非人灵长类动物的受精卵胞质中注入重组质粒。

8、进一步的，所述非人灵长类动物包括食蟹猴。

9、进一步的，所述的制作方法还包括s3、待非人灵长类动物出生后进行基因检测，以确定出生的非人灵长类动物实现了rag1基因和il2rg基因的敲除。

10、进一步的，检测rag1基因的上游引物序列如seq id no.3所示，检测rag1基因的下游引物序列如seq id no.4所示，和/或

11、检测il2rg基因的上游引物序列如seq id no.5所示，检测il2rg基因的下游引物序列如seq id no.6所示。

12、根据本发明实施例的第二方面，提供了一种上述方法制作的模拟免疫缺陷病单碱基基因编辑非人灵长类动物模型。

13、根据本发明实施例的第三方面，提供了一种上述模拟免疫缺陷病单碱基基因编辑非人灵长类动物模型于人肿瘤细胞成瘤中的应用。

14、根据本发明实施例的第四方面，提供了一种grna载体，包括特异靶向猴rag1基因的第一grna和/或特异靶向猴il2rg基因的第二grna，所述第一grna的序列如seq id no.1所示，所述第二grna的序列如seq id no.2所示；所述grna载体由第一grna和/或第二grna构建在质粒中得到。

15、根据本发明实施例的第五方面，提供了一种试剂盒，包括上述的grna载体。

16、与现有技术相比，本发明的优点包括：

17、本发明提供一种模拟免疫缺陷病单碱基基因编辑非人灵长类动物模型及其制作方法与应用，本发明提供的模拟免疫缺陷病单碱基基因编辑非人灵长类动物模型的制作方法，精确的将非人灵长类动物基因组中rag1基因1号外显子和il2rg基因的3号外显子引入一个终止密码突变，以达到破坏rag1蛋白和il2rg蛋白的表达，从而达到敲除基因的目的，实现构建rag1、il2rg双基因敲除的免疫缺陷非人灵长类动物模型。此外，本发明模拟免疫缺陷病单碱基基因编辑非人灵长类动物模型还可应用于人肿瘤细胞成瘤，具有广泛的市场前景。