本发明属于生物医药，涉及一种抗鸟苷酸环化酶2c(gucy2c)的纳米抗体及其应用。
背景技术：
：：1、鸟苷酸环化酶2c(gucy2c)是一种主要在人的肠上皮细胞表达的跨膜受体蛋白，其基因定位于人类12号染色体上，gucy2c的cdna包含一段3219bp的开放阅读框，共有27个外显子，编码由1073个氨基酸组成的相对分子质量约为120kda的蛋白，属于受体鸟氨酸环化酶家族成员。它的跨膜结构域和胞内结构域(激酶同源域、连接域和鸟苷酸环酶结构域)与其他膜结合的鸟苷酸环化酶具有同源性，而其独特的n端胞外域(残基1-430)决定了其配体特异性。2、在细胞外结构域，sta则与靠近跨膜区(87-393)的氨基酸微结构域结合，而sta的结合增大cgmp生成的机制仍然尚不清楚(参见：john c flickinger jr,jeffrey arappaport,joshua rbarton,et al.guanylyl cyclase c as a biomarker forimmunotherapies for the treatment of gastrointestinalmalignancies.biomark.med.(2021)15(3),201–217,doi:10.2217/bmm-2020-0359)。目前研究表明内源性配体鸟苷素和尿鸟苷素可以激活gucy2c，通过与gucy2c结合引起细胞内环磷酸鸟苷浓度升高，进一步激活cgmp依赖的蛋白激酶gⅱ，从而引起相应的生理变化。这种生理变化主要在维持肠道稳态、改善内脏痛觉高敏感、抑制肠组织恶变等多个方面起着关键作用(kuhn m.molecular physiology of membrane guanylylcyclasereceptors.physiol rev,2016,96(2):751-804,doi:10.1152/physrev.00022.2015.)。3、gucy2c是一种肠道组织特异性多肽，在正常肠道黏膜上皮及原发或继发性大肠癌中有表达(参见：frick gs,pitari gm,weinberg ds,et al.guanylyl cyclase c:amolecularmarker for staging and postoperative surveillance of patients withcolorectal cancer.expert rev mol diagn,2005,5(5):701-713.,doi:10.1586/14737159.5.5.701.)。免疫组织化学检测正常的肠组织、大肠癌组织和肠外组织中gucy2c的表达，并以癌胚抗原(cea)和细胞角蛋白20(ck20)作为对照，结果显示gucy2c在正常肠道组织以及大肠癌组织中阳性率分别为100％和80％，ck20为94％和100％，cea为94％和94％。gucy2c主要表达于肠黏膜隐窝和绒毛处，其中在绒毛中段表达最多，而在肠外组织中几乎不表达，而cea和ck20在食管癌和胃癌组织中均有不同程度的表达。gucy2c比cea与ck20的特异性和敏感性都要高，是检测大肠癌的有效指标(参见：buc e,vartanian md,darcha c,et al.guanylyl cyclase c as a reliable immunohistochemical markerand its ligand escherichia coli heat-stable enterotoxin as a potentialprotein-delivering vehicle for colorectal cancer cells.eur j cancer,2005,41(11):1618-1627,doi:10.1016/j.ejca.2005.02.031.)。4、gucy2c起初被称为sta受体，早前被确定为导致旅行者腹泻致病菌的热稳定肠毒素(sta)的受体。初期的研究表明，sta由产肠毒素大肠杆菌(etec)分泌，与其他致泻毒素(如霍乱毒素)相比，sta可导致肠道的环gmp(cgmp)积累。这表明，sta信号激活可能通过鸟苷酸环化酶，而鸟苷酸环化酶是已知的催化gtp转化为cgmp和焦磷酸的蛋白质家族成员之一，利用鸟苷酸环化酶催化结构域高度保守的序列，首次从大鼠小肠cdna文库中克隆出gucy2c，并证明它既是sta受体，也是cgmp积累的来源。gucy2c在所有脊椎动物中都较为保守，而gucy2c的突变是其对分泌的影响，其功能丧失可导致分泌减少和新生儿肠梗阻，而gucy2c功能获得将导致分泌增加和分泌性腹泻。5、目前最新研究表明gucy2c可能是治疗胃肠道癌症的一个极有潜力的免疫治疗靶点。早在2008年，就有利用靶向gucy2c制成疫苗的免疫治疗方法，研究者选择gucy2c的胞外结构域作为疫苗靶点，克隆到重组腺病毒血清型5(ad5)中，用于免疫原性和结直肠癌治疗研究，与对照组相比，ad5-gucy2c显著降低了肝和肺转移(结直肠癌转移最常见的两个部位)小鼠模型的肿瘤负担，并增加了小鼠的存活率。(参见：john c flickinger jr,jeffreya rappaport,joshua r barton,et al.guanylyl cyclase c as a biomarker forimmunotherapies for the treatment of gastrointestinalmalignancies.biomark.med.(2021)15(3),201–217.)。6、michael s.magee等人利用人类特异的gucy2c单链可变片段，构建靶向人类gucy2c表达转移瘤的cart细胞，促进抗原依赖性t细胞的激活，并且可以使激活标记物上调和细胞因子产生，并杀死gucy2c表达的肿瘤细胞。在同源移植小鼠模型，针对gucy2c的car-t细胞可以对表达人gucy2c的小鼠结直肠癌细胞的肺转移模型具有长期的保护作用。其次在免疫缺陷小鼠的人异种移植模型中，针对gucy2c的car-t细胞识别并杀死内源性表达gucy2c的人结直肠癌细胞，从而提供了模型持久的生存期。研究人员利用编码对人类gucy2c具有特异性的scfv的car设计，在结直肠肺转移模型中，剂量研究表明，单次注射最高剂量的107个car t细胞，有60％的动物可以治愈。并以这个剂量重复注射car-t细胞，在肿瘤移植后100天，治疗的存活率提高到80％。此外，75％的最初用gucy2c car-t细胞治疗的动物在肿瘤再次移植后存活了超过80天，这表明gucy2c cart细胞在初次用药后的6个月内仍能持续存在并发挥作用。此外，在腹膜转移的cdx模型中，使用人类结直肠癌细胞系t84进行成瘤实验，构建的人类gucy2c的car-t细胞对100％的测试动物都有治愈作用。上述情况有力地支持了gucy2c导向的car-t细胞疗法在胃肠道恶性肿瘤的临床应用中具有极其潜在的价值。(magee ms,abraham ts,baybutt tr,et al.human gucy2c-targeted chimericantigen receptor(car)-expressing t cells eliminate colorectal cancermetastases.cancer immunol.res.6(5),509–516(2018).)。7、综上所述，gucy2c可作为肿瘤治疗的靶点，提供一种具备高特异性和亲和力的抗gucy2c抗体，对于治疗恶性肿瘤具有重要意义。技术实现思路1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种抗鸟苷酸环化酶2c的纳米抗体及其应用，本发明的抗gucy2c的纳米抗体具有高亲和力，能够作为嵌合抗原受体分子的抗原结合结构域制备car-t细胞，所得car-t细胞在肿瘤治疗方面具有较好的应用前景。2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：3、第一方面，本发明提供一种抗鸟苷酸环化酶2c的纳米抗体，所述纳米抗体的cdr1的氨基酸序列包括seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3所示的序列，所述纳米抗体的cdr2的氨基酸序列包括seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq idno.8、seq id no.9或seq id no.10所示的序列，所述纳米抗体的cdr3的氨基酸序列包括seq id no.11、seq id no.12、seq id no.13所示的序列。4、本发明中，以鸟苷酸环化酶2c重组蛋白免疫一只未经免疫的羊驼，构建噬菌体展示纳米抗体库，根据该噬菌体展示纳米抗体库对抗鸟苷酸环化酶2c抗体进行筛选，得到可特异性的结合鸟苷酸环化酶2c抗原的单克隆抗体，所述抗体属于单域抗体。5、本发明提供的抗gucy2c的纳米抗体具有高亲和力，能够作为嵌合抗原受体分子的抗原结合结构域制备car-t细胞，所得car-t细胞在肿瘤治疗方面具有较好的应用前景。6、seq id no.1：gytyssyc。7、seq id no.2：ginyrnyc。8、seq id no.3：gytrgtha。9、seq id no.4：idsdgst。10、seq id no.5：iyngd。11、seq id no.6：iynga。12、seq id no.7：iynaa。13、seq id no.8：syngd。14、seq id no.9：vetdgnt。15、seq id no.10：myngd。16、seq id no.11：aadgpgrcyggywyrspkisfgi。17、seq id no.12：aagaqflcannnwyqhlyty。18、seq id no.13：aagdtvasrwyarrtspmavrgynd。19、优选地，所述纳米抗体的cdr1的氨基酸序列包括seq id no.1所示的序列，cdr2的氨基酸序列包括seq id no.4所示的序列，cdr3的氨基酸序列包括seq id no.11所示的序列；20、优选地，所述纳米抗体的cdr1的氨基酸序列包括seq id no.2所示的序列，cdr2的氨基酸序列包括seq id no.5所示的序列，cdr3的氨基酸序列包括seq id no.12所示的序列；21、优选地，所述纳米抗体的cdr1的氨基酸序列包括seq id no.2所示的序列，cdr2的氨基酸序列包括seq id no.6所示的序列，cdr3的氨基酸序列包括seq id no.12所示的序列；22、优选地，所述纳米抗体的cdr1的氨基酸序列包括seq id no.2所示的序列，cdr2的氨基酸序列包括seq id no.7所示的序列，cdr3的氨基酸序列包括seq id no.12所示的序列；23、优选地，所述纳米抗体的cdr1的氨基酸序列包括seq id no.2所示的序列，cdr2的氨基酸序列包括seq id no.8所示的序列，cdr3的氨基酸序列包括seq id no.12所示的序列。24、优选地，所述纳米抗体的cdr1的氨基酸序列包括seq id no.3所示的序列，cdr2的氨基酸序列包括seq id no.9所示的序列，cdr3的氨基酸序列包括seq id no.13所示的序列。25、优选地，所述纳米抗体的cdr1的氨基酸序列包括seq id no.2所示的序列，cdr2的氨基酸序列包括seq id no.10所示的序列，cdr3的氨基酸序列包括seq id no.12所示的序列。26、优选地，所述纳米抗体的重链可变区还包括：seq id no.14或seq id no.15、seqid no.16或seq id no.17所示的框架区1(fr1)、seq id no.18、seq id no.19或seq idno.20所示的框架区2(fr2)、seq id no.21、seq id no.22、seq id no.23、seq id no.24或seq id no.25所示的框架区3(fr3)和seq id no.26或seq id no.27所示的框架区4(fr4)。27、seq id no.14：qvklvqsggglvqpggslrlscaas。28、seq id no.15：qvklvqsgggsvqaggslrlscaas。29、seq id no.16：evklvesgggsvqaggslrlsceas。30、seq id no.17：qvqlvesgggsvqaggslrlscaas。31、seq id no.18：mgwfrqapgkeregvaa。32、seq id no.19：mawfrqapgkqregvar。33、seq id no.20：mgwfrqapgkeregvat。34、seq id no.21：35、syadsvkgrftiskdnakntlylqmnslepedtamyyc。36、seq id no.22：37、syadsvkgrftisqdnakntlylqmnslkpedtamyyc。38、seq id no.23：39、syadsvkgrftisqdnakntlylqmnslkpedtavyyc。40、seq id no.24：41、syadsvkgrftisqdnaknlvylqmnslkpedtamyyc。42、seq id no.25：43、ryadsvkgrftiikdnakntlylqmnslkpddtamyyc。44、seq id no.26：wgqgtqvtvss。45、seq id no.27：wgqgtqvtvst。46、优选地，所述纳米抗体的重链可变区包括seq id no.28、seq id no.29、seq idno.30、seq id no.31、seq id no.32、seq id no.33或seq id no.34所示的氨基酸序列。47、seq id no.28：48、qvklvqsggglvqpggslrlscaasgytyssycmgwfrqapgkeregvaaidsdgst syadsvkgrftiskdnakntlylqmnslepedtamyycaadgpgrcyggywyrspkisfg iwgqgtqvtvss。49、seq id no.29：50、qvklvqsgggsvqaggslrlscaasginyrnycmawfrqapgkqregvariyngds yadsvkgrftisqdnakntlylqmnslkpedtamyycaagaqflcannnwyqhlytyw gqgtqvtvss。51、seq id no.30：52、evklvesgggsvqaggslrlsceasginyrnycmawfrqapgkqregvariyngasy adsvkgrftisqdnakntlylqmnslkpedtavyycaagaqflcannnwyqhlytywg qgtqvtvst。53、seq id no.31：54、qvklvqsgggsvqaggslrlscaasginyrnycmawfrqapgkqregvariynaas yadsvkgrftisqdnaknlvylqmnslkpedtamyycaagaqflcannnwyqhlytyw gqgtqvtvss。55、seq id no.32：56、qvklvqsgggsvqaggslrlscaasginyrnycmawfrqapgkqregvarsyngds yadsvkgrftisqdnakntlylqmnslkpedtamyycaagaqflcannnwyqhlytyw gqgtqvtvss。57、seq id no.33：58、qvqlvesgggsvqaggslrlscaasgytrgthamgwfrqapgkeregvatvetdgn tryadsvkgrftiikdnakntlylqmnslkpddtamyycaagdtvasrwyarrtspmavr gyndwgqgtqvtvss。59、seq id no.34：60、qvklvqsgggsvqaggslrlscaasginyrnycmawfrqapgkqregvarmyngd syadsvkgrftisqdnakntlylqmnslkpedtamyycaagaqflcannnwyqhlyty wgqgtqvtvss。61、本发明中，利用噬菌体展示技术对鸟苷酸环化酶2c免疫骆驼vhh文库进行筛选，得到的纳米抗体具备高亲和性，在构建靶向鸟苷酸环化酶2c的嵌合抗原受体方面具有重要的应用前景。62、第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子包括第一方面所述的抗gucy2c的纳米抗体的编码基因。63、第三方面，本发明提供一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、铰链区、跨膜区和信号转导结构域，所述抗原结合结构域包括第一方面所述的抗鸟苷酸环化酶2c的纳米抗体。64、优选地，所述信号肽包括cd8α信号肽。65、优选地，所述铰链区包括cd8α铰链区。66、优选地，所述跨膜区包括cd8α跨膜区、cd28跨膜区或dap10跨膜区中的任意一种或至少两种的组合。67、优选地，所述信号转导结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序(cd3ζ)。68、优选地，所述信号转导结构域还包括共刺激分子，所述共刺激分子包括4-1bb、cd28胞内区、ox40、icos或dap10胞内区中的任意一种或至少两种的组合。69、优选地，所述嵌合抗原受体包括cd8α信号肽、第一方面所述的抗鸟苷酸环化酶2c的纳米抗体、cd8α铰链区、cd8α跨膜区和免疫受体酪氨酸活化基序。70、第四方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包括第三方面所述的嵌合抗原受体的编码基因。71、优选地，所述表达载体为含有第三方面所述的嵌合抗原受体的编码基因的慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。72、第五方面，本发明提供一种重组慢病毒，所述重组慢病毒含有第四方面所述的表达载体。73、优选地，所述重组慢病毒由转染第四方面所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞制备得到。74、第六方面，本发明提供一种嵌合抗原受体免疫细胞，所述嵌合抗原受体免疫细胞表达第三方面所述的嵌合抗原受体。75、优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞包括第四方面所述的表达载体和/或第五方面所述的重组慢病毒。76、优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞包括t细胞、b细胞、nk细胞、肥大细胞或巨噬细胞中的任意一种或至少两种的组合。77、第七方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第六方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞和/或第一方面所述的纳米抗体。78、优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。79、优选地，所述辅料包括载体、表面活性剂、崩解剂、包衣材料、赋形剂、增溶剂、稀释剂、ph调节剂、粘合剂、润湿剂、着色剂、乳化剂、抑菌剂、助溶剂、渗透压调节剂、填充剂、抗氧剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。80、第八方面，本发明提供第一方面所述的抗鸟苷酸环化酶2c的纳米抗体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的嵌合抗原受体、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的重组慢病毒、第六方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞或第七方面所述的药物组合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。81、优选地，所述肿瘤包括表达鸟苷酸环化酶2c的肿瘤。82、与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：83、(1)本发明以gucy2c重组蛋白免疫未经免疫的羊驼，构建噬菌体展示纳米抗体库，根据该噬菌体展示纳米抗体库对抗gucy2c抗体进行筛选，所得纳米抗体可特异性的结合gucy2c抗原，且亲和力较好，通过抗体亲和力的测定可知，其kd(m)分别为2.75×10-11、1.80×10-8、1.26×10-8、1.09×10-8、2.08×10-8、5.20×10-8和1.82×10-8；84、(2)本发明提供的抗gucy2c的纳米抗体具有较好的亲和力，将其作为抗原结合结构域构建嵌合抗原受体，并利用该嵌合抗原受体制备t细胞，所述car-t细胞对gucy2c阳性的肿瘤细胞具有杀伤活性，且与gucy2c阳性细胞共培养后，高效分泌细胞因子ifn-γ，所述纳米抗体能够有效应用于免疫治疗，对于开发肿瘤治疗药物具有重要意义。当前第1页12当前第1页12