薰衣草BAHD酰基转移酶基因及其在制备乙酸芳樟酯中的应用

本发明涉及植物分子生物学和基因工程，具体涉及的是薰衣草labahd57酰基转移酶蛋白、编码基因及应用。

背景技术：

1、薰衣草(lavandula angustifolia mill.)为唇形科(lamiacea)薰衣草属(lavandula)的多年生亚灌木，全属约含39个种，此外还有24个野生类群、16个杂交种，品种数量在400种以上。薰衣草中主要生产精油的种为狭叶薰衣草(l.angustifolia)、宽叶薰衣草(l.latifolia)以及二者的天然杂交种杂薰衣草(l.×intermedia)，而其中，狭叶薰衣草的精油品质最佳。从薰衣草中提取出的精油，具有芳香气味，常用作芳香剂、驱虫剂及配制香精的原料，具有镇静催眠、抗炎与抗氧化，降脂与降血压、抗菌抑菌、解痉、抑制肿瘤、吸引/趋避昆虫等作用。

2、作为一种著名的芳香植物，薰衣草含有丰富的次生代谢物，其中尤以其精油的主要组成成分单萜化合物、倍半萜化合物及酯类化合物最为重要。薰衣草的特征香气成分为乙酸芳樟酯(linalyl acetate)和芳樟醇(linalool)等。乙酸芳樟酯香气幽雅，为芳樟醇的乙酰化产物，是制备高级香精不可缺少的香料，在日化、烟草和食品工业中占有十分重要的地位。目前市面上使用的乙酸芳樟酯多数是通过化学合成的方式获得的，随着人们绿色、环保意识的增强，对天然合成原料需求量激增，且在日化、食品等方面的特殊用途中化学合成乙酸芳樟酯很难完全代替天然乙酸芳樟酯。化学合成或从植物中提取天然乙酸芳樟酯面临着材料难以获得、步骤繁琐、提取分离困难、成本高、研究少，环境污染等问题，极大限制了乙酸芳樟酯的规模化利用。因此利用生物工程技术，建立微生物工厂合成天然乙酸芳樟酯，具有极大的应用前景。

3、酰基化是植物生长发育过程中对其次生代谢产物修饰的重要过程。作为裁剪酶，bahd酰基转移酶普遍存在于植物、动物和微生物中，这有助于次生代谢产物的多样性，但在薰衣草中，关于bahd酰基转移酶的研究较少。研究发现，参与挥发性酯生物合成的bahd基因属于iiia和va分支，且薰衣草醇可经bahd乙酰基转移酶(alcohol acetyltransferases，aat)催化形成乙酸薰衣草酯。而催化芳樟醇形成乙酸芳樟酯的乙酰基转移酶迄今为止尚未报道。克隆薰衣草中的bahd基因并研究其功能有助于为高精油品质薰衣草的形成提供理论基础，同时为利用基因工程技术生产天然乙酸芳樟酯带来广阔的应用空间。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种高效合成乙酸芳樟酯的薰衣草bahd酰基转移酶labahd57蛋白、编码基因及应用。

2、本发明首先提供了一种蛋白，包括如下1)-3)所示：

3、1)seq id no.2所示的氨基酸序列；

4、2)与seq id no.2所示的序列具有相同功能，且通过取代、缺失或增加一个或多个氨基酸而获得的序列；

5、3)与seq id no.2所示的蛋白质具有相同功能，且n端或c端连接标签得到的融合蛋白质。上述蛋白质，蛋白标签是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。

6、还提供了一种编码所述的薰衣草labahd57蛋白的基因，其中，所述编码基因为如下中至少一种：

7、1)seq id no.1所示的核苷酸序列；

8、2)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交且编码所述蛋白质的dna分子；

9、3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有90％以上的同一性且编码所述蛋白质的核苷酸序列；

10、4)由seq id no.1所示的序列通过取代、缺失或增加核苷酸而获得的序列；

11、5)由seq id no.1所示的核苷酸序列产生的不同转录本或者同源基因序列。

12、还提供了一种含有所述编码基因的重组载体、表达盒、重组菌、重组细胞。

13、基于薰衣草全基因组数据及不同器官/组织转录组差异表达分析以及与已知功能的bahd酰基转移酶蛋白构建系统发育进化树分析，筛选出可能参与乙酸芳樟酯合成的labahd基因seq id no.1所示的核苷酸序列，或与所述的核苷酸序列与表达载体重组后导入到受体微生物中，表达载体具体为patx-mbp，受体微生物具体为大肠杆菌t7e，得到表达labahd57蛋白质或与其具有相同功能的蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到蛋白。

14、还提供了所述蛋白以芳樟醇为底物，催化生成乙酸芳樟酯的应用。

15、还提供了所述的重组载体、表达盒、重组菌、重组细胞在催化芳樟醇生成乙酸芳樟酯中的应用。

16、还提供了一种扩增所述基因的引物，所述引物如seq id no.3～seq id no.4所示。

17、还提供了一种制备所述的1)-3)蛋白质方法，所述方法包括：将所述编码基因的核苷酸序列与表达载体重组后导入到受体微生物中，得到重组菌株，培养所述重组菌株，表达得到所述的蛋白质。

18、还提供了一种制备乙酸芳樟酯的方法，所述方法包括用所述的蛋白质催化芳樟醇生成乙酸芳樟酯。通过mbp纯化labahd57蛋白，在缓冲液中进行labahd57蛋白体外酶促反应，通过固相微萃取技术和气质联用(gc-ms)技术检测labahd57基因在原核表达体系体外的催化产物，获得催化产物乙酸芳樟酯。

19、本发明还提供一种提高植物乙酸芳樟酯的方法，其包括：

20、1)用含有所述基因的过表达载体转化植物细胞；

21、2)将转化的植物细胞培育成植株。

22、正常生长的野生型烟草含有芳樟醇但不含有乙酸芳樟酯。通过叶盘法将labahd57在烟草中稳定过表达，发现转基因烟草中产生了乙酸芳樟酯。

23、上述方法中，所述转基因植物理解为不仅仅包含所述labahd57基因转化目的植物得到的t1代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可以用常规育种技术将该基因转移到其它物种中，所述转基因植物包括种子、愈伤、完整植株或细胞。

24、本发明从薰衣草中克隆得到labahd57酰基转移酶，该基因是首次从薰衣草中得到的重要挥发性酯类化合物乙酸芳樟酯合成的关键酶基因。通过实验证明本发明的labahd57能够催化芳樟醇形成乙酸芳樟酯，这对进一步解析薰衣草中酯类化合物的合成具有重要作用，对进一步提高乙酸芳樟酯产量，提高精油品质具有重要意义。

技术特征：

1.薰衣草labahd57蛋白，其特征在于，其为

2.一种编码权利要求1所述的薰衣草labahd57蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，为如下中至少一种：

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、重组菌、重组细胞。

5.权利要求1所述的蛋白或者权利要求2或3所述的基因在以芳樟醇为底物，催化生成乙酸芳樟酯中的应用。

6.权利要求4所述的重组载体、表达盒、重组菌、重组细胞在催化芳樟醇生成乙酸芳樟酯中的应用。

7.制备权利要求1所述的蛋白质的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求2或3所述的基因与表达载体重组后导入到受体微生物中，得到重组菌株，培养所述重组菌株并诱导蛋白表达。

8.一种制备乙酸芳樟酯的方法，其特征在于：所述方法包括用权利要求1所述的蛋白质催化芳樟醇生成乙酸芳樟酯。

9.一种提高植物乙酸芳樟酯的方法，其包括：

技术总结
本申请涉及一种薰衣草BAHD酰基转移酶基因，编码的蛋白及其在制备乙酸芳樟酯中的应用。本发明首次从狭叶薰衣草‘京薰2号’腺毛中克隆得到LaBAHD57基因，是酯类化合物乙酸芳樟酯生物合成的关键酶基因，也是植物中首次发现的催化生成乙酸芳樟酯的重要基因。通过实验证明：本发明的LaBAHD57蛋白能够催化芳樟醇(Linalool)形成乙酸芳樟酯(Linalyl acetate)，对薰衣草中乙酸芳樟酯的合成研究、薰衣草精油品质的提高、丰富和完善酯类化合物对植物的生理生态作用具有重要的理论及实际意义。

技术研发人员：石雷,张文颖,李靖锐,李慧,夏菲,白红彤
受保护的技术使用者：中国科学院植物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16