IFITM1基因与猪间性病相关的SNP分子标记、引物及应用

本发明涉及猪选择育种，尤其涉及一种ifitm1基因与猪间性病相关的snp分子标记、引物及应用。

背景技术：

1、在猪的引种或精液的推广中，常常要求出口方在系谱上标识或在销售合同条款中写明种猪没有遗传缺陷病。然而，由于受制于猪遗传缺陷病的携带者没有表现性状，因此无法有效根除杂合子或无法判断遗传缺陷的病因，导致选育工作出现一定的瓶颈。此外，猪间性病是严重影响种源优质化的遗传缺陷病，多发生在引进的种用的长白猪、大白猪及其杂交商品猪中，是我国乃至世界养猪产业面临的一个技术选育瓶颈问题。此外，猪与人类在解剖学尺寸和结构、生理学、免疫学以及基因组等方面的相似性增强了它们作为人类模型的潜力。因此，猪间性病也能为人的相关疾病提供参考价值。

2、性别发育异常(disorder ofsex development，dsd)是先天遗传因素所导致的疾病，导致外生殖器表型和个体遗传的染色体的不同，在大多数患间性病的猪种中，拥有正常雌性染色体结构(38,xx)，且不含雄性性别决定基因(sex determining regiony，sry-)，其性腺发育成卵睾体(ovotestis，ot)或未成熟的睾丸(testis，t)，这种疾病被称为猪38,xx-ot/t-dsd(sry-)。xx-ot/t-dsd(sry-)属于常染色体遗传疾病，其发病率在不同猪群种中大约为0.1～0.6％左右，而在一些独立近交群体中发病率可高达20％。间性猪不但会导致不孕不育，还会导致生长发育、成活率下降，且因为公猪的膻味而导致屠体等级下降，还会表现出一定的好斗性，严重制约着我国乃至世界养猪生产业优质种猪的生产。目前，我国的生猪养殖方式主要采用集约化养殖，大量采用人工受精技术进行种猪繁育和保种，导致了间性猪发病率的风险增大。若能对人工授精的种公猪或其精液进行分子筛查，避免间性病通过人工授精1(♂):80～200(♀)放大传播，可达到辅助消除间性猪的危害，为我国提供优质的种猪提供保障。通过预防间性病，可以有效提高猪场的经济效益。目前对其遗传模式和分子病因并不十分清楚，探讨猪间性病的成因对降低疾病发生率具有重要意义。本发明运用高通量测序技术和分子生物学手段鉴别猪间性病的致病基因，开发分子标记将有助于预防猪群中间性病的发生。

3、作为第三代分子标记技术的单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，snp)，其具有共显性、自动化检测、遗传多样性丰富等特点，在医学以及动物疾病的分型与鉴定中得到广泛应用。目前，在哺乳动物xx-dsd的研究中，已报道了多个与xx-dsd相关的snp，如人类r-脊椎蛋白1(r-spondin1，rspo1)基因的furin-like富半胱氨酸结构域-2(furin-like cysteine-rich domain-2，fu-crd2)中的纯合突变c.332g>a(p.cys11tyr)，以及rspo1基因的纯合突变c.43_43dela(p.thr15argfs*77)均与46,xx-dsd相关。人类wnt家族成员4(wnt family member4 gene，wnt4)杂合子错义突变能导致46,xx的妇女出现不同程度的男性化，包括雄激素过量和苗勒管发育异常，而wnt4的纯合子突变能引起46,xx-dsd。研究发现核受体亚家族5组a成员1(nuclearreceptor subfamily5group a member 1，nr5a1；又称类固醇合成因子1，steroidogenic factor-1，sf1)基因c.274c>t(p.arg92trp)的杂合突变导致sf1抑制雌性分化过程中关键分子的功能，如β-catenin和核受体亚家族0组b成员1基因(nuclear receptor subfamily 0group b member1，nr0b1)由于错义突变引起人类46,xx-ot/t-dsd。在46,xx-t-dsd(sry-)患者中，发现了腺肌肉瘤相关基因1(wilms tumor associated gene 1，wt1)的一个杂合移码突变位点，通过建立晶体学模型进行分析，发现该突变为有害突变，导致wt1蛋白第四锌指区(the fourthzinc finger，zf4)失活。随后，eozenou等进一步在wt1基因发现了5个杂合突变，它们分别是p.ser478thrfs*17、p.pro481leufs*15、p.lys491glu、p.arg495gln和p.arg495gly。这些突变能使睾丸支持细胞相关的转录因子在人类卵巢细胞中上调表达，而且wt1arg495gly/arg495gly的雌性小鼠启动xx个体睾丸形成，是导致46,xx-ot/t-dsd的原因。在研究猪xx-ot/t-dsd(sry-)方面，rousseau等发现在xx-dsd猪中，包含9个snp的单倍型频率升高，与xx-dsd猪相关最显著的是位于sox9下游约148kb的snp rs81341093(m1ga0024789)。但在随后在的研究中，却发现这个位点与猪xx-ot/t-dsd并没有关联性。因此，与猪xx-ot/t-dsd紧密相关的snp标记有待进一步挖掘。

4、前人研究表明，干扰素诱导跨膜蛋白家族(interferon-inducibletransmembraneprotein families，ifitms)在抑制细胞增殖、促进同型细胞粘附和介导生殖细胞发育等方面发挥着重要作用。性腺由生殖细胞和体细胞共同形成，外胚层的原始生殖细胞通过主动迁移至由中胚层分化的性腺中，共同组成生殖嵴。原始生殖细胞属于生殖细胞谱系，其迁移对自身生存和分化起到重要的作用，原始生殖细胞迁移的缺陷可能导致不育。其中，扰素诱导的跨膜蛋白1基因(interferon-inducible transmembrane protein-1，ifitm1)具有抗增殖与促进同类型细胞粘附的作用，在胚胎发育时期能够表达能够促进器官的发育。在斑马鱼和大鼠中，ifitm最初在原肠发育和早期器官发生过程中表现出动态的时空表达模式。ifitm1在近端上胚层的表达，表达于外胚层、中胚层和原始生殖细胞，随后ifitm1只在中胚层旁表达，而不在原始生殖细胞中表达，说明小鼠ifitm1是原始生殖细胞从中胚层向内胚层迁移所必要的，在器官发生过程中起着重要作用。此外，ifitm1基因作为wnt/β-catenin信号通路的下游靶点，ifitm1干扰能造成胚胎畸形。但目前尚未有ifitm1基因与猪间性病相关研究的报道。有鉴于此，本发明对ifitm1基因展开研究，提供一种ifitm1基因的与猪间性病相关的分子标记及其引物。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种ifitm1基因与猪间性病相关的snp分子标记、引物及应用，该snp分子标记与猪间性病性状密切相关，通过本发明公开的引物检测snp位点，能对携带致病基因的个体进行筛选，用于种猪育种选择，预防猪间性病的传播。

2、为达此目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种ifitm1基因与猪间性病相关的snp分子标记，该分子标记的核苷酸序列为seqid no:1，所述snp分子标记的核苷酸序列中第32个碱基y处为多态位点；在该多态位点处，基因型为tt和tc的个体表现为间性病特征，基因型为cc的个体无间性病特征；所述snp分子标记位于猪2号染色体的ifitm1基因中第2个外显子。

4、具体的，ifitm1基因与猪间性病相关的snp分子标记的核苷酸序列seq id no:1为：gcgagggaccggaagatggtgggagacatcay(t/c)tggggcccagagctatgcctccaccgccaagtgcctgaacatctgggctctgatcctgggcctcattctgaccatcggagccactgttcttctggtgtttgtatacataacagcctaccatatgttagagcgcgcaaagagtaacagaggctactag。

5、根据本发明的是实施例，在snp分子标记的多态位点处，基因型tt和tc的个体表现为间性病特征；在snp分子标记的多态位点处的基因型为cc的个体性别发育正常，因此，该snp分子标记与38,xx-dsd猪的发生密切关联。具体的，该snp分子标记的多态位点，突变导致碱基c突变为碱基t，即极性氨基酸苏氨酸(thr)变成非极性氨基酸异亮氨酸(iie)，则错义突变导致猪群发生异常。在种猪选育工作中，剔除该snp分子标记基因型为tt和tc的个体，预防种猪群中间性病的发生。因此，ifitm1基因与猪间性病相关的snp分子标记用于种猪选育，具有早期筛选、节省时间、成本低廉、准确性高的优点。

6、本发明还提供一种ifitm1基因与猪间性病相关的snp分子标记的引物，该引物用于扩增上述的ifitm1基因与猪间性病相关的snp分子标记，该引物包括上游引物和下游引物：

7、上游引物f1：5’-tcacccttgggactcagacc-3’，

8、下游引物r1：5’-agtgtggatggtgggggac-3’。

9、根据本发明的实施例，利用上述引物对待测种猪的dna进行pcr扩增，扩增出目的snp分子标记片段，通过凝胶电泳检验是否成功扩增。若成功则送去进行sanger测序，根据测序结果判断突变位点的基因型，有效确定该种猪是否携带致病基因。由此，用于检测上述snp分子标记的引物对，能够有效用于种猪早期筛选即种猪选育，进而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地筛选种猪优良品种。

10、本发明提供的技术方案可以包括以下有益效果：

11、本发明利用高通量10×genomics(60×)测序技术，结合从头组装(de novo)方法进行基因组变异检测，该方法相比于重测序方法能克服多重比对问题，具有更强的特异性，对高变区检测具有更强的敏感性，因而能够捕获更多且更加可靠的snp信息，进而得到ifitm1基因与猪间性病相关的snp分子标记。将该分子标记应用于种猪的选择育种，利用分子技术筛选剔除疑似有害个体，有助于预防猪群间性病的发生，以达到种源优化的目的，该筛选个体的不受年龄和性别的限制。

12、本发明中，以pcr-rflp鉴别snp分子标记，snp分子标记中的核苷酸的突变位点是酶切位点，根据电泳结果即可得出被检测个体的基因分型，应用于种猪育种的操作便捷、时间短、灵敏度高，检测结果更直观。