一种获得狐尾藻转基因植株的方法与流程

本发明属于狐尾藻转基因的，具体涉及一种获得狐尾藻转基因植株的方法。

背景技术：

1、狐尾藻(myriohpyllum verticillatum)为小二仙草科狐尾藻属植物，水生草本，世界各地广有分布。狐尾藻不仅是鱼虾蟹养殖过程中的饵料、避难和产卵场所，也是目前湖泊生态修复工程中的净水物种和植被恢复先锋物种，此外因狐尾藻粗蛋白含量高，具有制备成青贮饲料用以家禽家畜饲养的潜力。

2、转基因技术是指利用分子生物学方法，将来源于不同生物或同种生物的有利基因导入到目标生物中，使目标生物在原有遗传特性基础上增加新的功能特性，获得新的品种，生产新的产品。转基因农作物新品种研发已从抗虫、抗除草剂等第一代产品，向改善营养品质和提高产量的第二代产品转变。目前常见的植物转基因方法有三种：农杆菌介导转化法、基因枪介导转化法、花粉管通道法；目前最常见的转基因方法是农杆菌介导转化法，其存在一个限制因素：即待转化植株需通过无菌培养先诱导愈伤组织，经农杆菌浸染共培后再筛选抗性愈伤并诱导植株再生和生根，转化率低且不通用于所有植物；基因枪介导转化法在目前的转基因研究中应用也较为广泛，但此方法成本高，嵌合率高，遗传稳定性差；花粉管通道法相对于以上两种方法应用范围更广，但其转化技术不完善，对转化机制缺乏系统的研究，且局限于开花期才能应用。

技术实现思路

1、本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种操作简单快捷、操作周期短、转化效率高、成本低的获得狐尾藻转基因植株的方法。

2、为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

3、所述获得狐尾藻转基因植株的方法包括如下步骤：

4、(1)狐尾藻丛生芽的获得：选择优良的狐尾藻植株的茎段为外植体，将外植体消毒处理后在添加有ba1、kt、iaa、naa的ms琼脂固体培养基上培养20～30d，诱导出带丛芽的外植体；所述6-ba、kt、iaa、naa在ms琼脂固体培养基中的浓度分别为1～2mg/l、0.1～0.5mg/l、0.1～0.5mg/l、0.1～1mg/l，优选为1mg/l、0.5mg/l、0.3mg/l、0.5mg/l；

5、(2)根癌农杆菌的共培：用根癌农杆菌菌液浸染从带小芽丛的外植体上切下的狐尾藻茎段，进行共培养；

6、(3)抗性芽的筛选：将经共培养后的狐尾藻茎段接种到添加有6-ba、kt、iaa、naa、头孢霉素、羧苄青霉素、潮霉素的ms筛选培养基中筛选培养得到抗性苗，阳性苗出苗率达8％～15％；所述6-ba、kt、iaa、naa、头孢霉素、羧苄青霉素、潮霉素在ms筛选培养基中的浓度分别为1～2mg/l、0.1～0.5mg/l、

7、0.1～0.5mg/l、0.1～1mg/l、500mg/l、400mg/l、50mg/l；优选为1mg/l、0.5mg/l、

8、0.3mg/l、0.5mg/l、500mg/l、400mg/l、50mg/l；

9、(4)抗性苗的生根培养：将抗性苗接种到添加有naa和iaa的ms琼脂固体培养基中进行生根培养；所述naa和iaa在ms琼脂固体培养基中的浓度分别为0.1～1.5mg/l和0.1～1mg/l，优选为0.5mg/l和0.5mg/l；

10、(5)将步骤(4)中的抗性生根苗移栽至温室，然后移栽至大田并进行检测，筛选出转基因成功的植株。

11、优选地，步骤(1)中所述外植体消毒处理是将狐尾藻植株的茎剪成长2～4cm，用洗衣粉清洗干净，在无菌操作台上用无菌水洗5～7次，用70％酒精浸润30s，再放入0.1％的升汞溶液中灭菌10～15min，无菌水冲洗5～6次，备用。

12、优选地，步骤(1)中还包括将诱导出的带丛芽的外植体进行继代培养的步骤：将老茎剪成2～4cm、丛芽切成0.5cm×0.5cm后转入步骤(1)所述的添加有ba1、kt、iaa、naa的ms琼脂固体培养基中，每隔28～30d继代一次。

13、优选地，步骤(2)所述根癌农杆菌的共培具体步骤如下：

14、①提前三天准备根癌农杆菌菌液：lb固体培养基灭菌后冷却至60℃，然后加入kan、chl和rif，所述kan、chl和rif在lb固体培养基中的浓度分别为100mg/l、34mg/l和100mg/l；根癌农杆菌菌液的涂布在添加有kan、chl和rif的lb固体培养基上，28℃倒置培养2～3d，培养好的lb平板菌洗脱到添加有as的ms液体共培养基中，调od600＝0.5，所述as在ms液体共培养基中的浓度为0.1mm；得到根癌农杆菌菌液，；

15、②农杆菌介导转化：将将经步骤(3)继代培养后的带丛芽的外植体剪成2～4cm的茎段，转移到根癌农杆菌菌液中浸泡共培养3d，共培养条件是25℃～28℃下暗培养。

16、优选地，步骤(3)所述筛选培养的时间为10～15d。

17、优选地，步骤(4)所述生根培养的时间为15～20d，生根后进行移栽。

18、优选地，步骤(1)、(3)和(4)的培养温度为24±2℃，在1000～2000lx弱光环境中，每天进行10～12h光照培养。

19、优选地，所述步骤(5)是将步骤(4)养有抗性苗植株的培养瓶盖拧松并打开1/4，室温放置2d，再将培养瓶盖全部打开于室温(18-25℃)继续放置2d，然后流水冲洗掉培养基，于自来水中室温培养5～7d，最后移栽入水田，20～30d后即取样进行pcr初步检测，阳性苗中转基因成功率达90％以上。

20、更优选地，所述方法还包括对经过pcr初步检测的转基因成功植株进行实时荧光定量pcr检测的步骤，最终获得转基因植株。

21、下面对本发明作进一步说明：

22、本发明从茎段诱导小芽丛的培养基配方是经过大量探索试验得到，不同于现有技术中狐尾藻外植体先诱导愈伤组织，再移入分化增殖用的培养基，而是由茎段直接诱导出大量小芽丛，显著节省时间，提高快繁的效率。

23、本发明根据狐尾藻作为水生植株的特性，利用狐尾藻茎段的高效吸水能力，大胆采用将茎段在液态根癌农杆菌菌液中共培养的方式，让农杆菌与剪切的狐尾藻茎段密切接触，进而实现高效转化，发现浸染和转化效率都很理想。

24、发明人通过大量探索试验得到的培养基配方，既要适合本发明第(1)步的从茎段诱导小芽丛，也要适用于转染农杆菌之后的茎段培养，因为经过农杆菌转化之后的茎段在生理生化特性上会有一些改变。本发明步骤(3)由茎段直接诱导出小芽丛或者小苗，而无需先诱导愈伤组织，再进行分化，也显著节省时间，提高了快繁的效率。

25、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

26、1、本发明不需要诱导愈伤再进行分化，直接由茎段诱导小芽丛，显著节省了培养时间，提高了培养效率。

27、2、将狐尾藻茎段直接浸入农杆菌菌液中，既能诱导伤口抽出新芽，又能利用狐尾藻茎段的高效吸水能力，让农杆菌与剪切的狐尾藻茎段密切接触，进而实现高效转化。

28、3、本发明用菌液共培养代替固体共培养，并且菌液共培结束后无需无菌水冲洗，而直接接入筛选培养基，简化了操作步骤。

29、4、此外本发明成本低，嵌合率低，转化率高，遗传稳定性好，且不受开花期的时间影响，因此本发明进一步拓展了植物转基因技术的应用范围。

30、本发明经潮霉素筛选后，阳性苗高达8％-15％，经pcr初步检测，阳性苗中转基因成功的概率高达90％以上，经实时荧光定量pcr检测，目的基因得以表达的植株概率可达75％以上。

31、总之，本发明所述方法不需要诱导愈伤，而是将狐尾藻茎段直接浸入农杆菌菌液(狐尾藻液体分化培养基洗脱农杆菌od600＝0.5)中，即能快速诱导伤口抽出新芽，又能利用狐尾藻茎段的高效吸水能力，让农杆菌与剪切的狐尾藻茎段密切接触，进而实现高效转化，此外本发明成本低，嵌合率低，遗传稳定性好，且不受开花期的时间影响，因此本发明进一步拓展了植物转基因技术的应用范围。本发明提供的快速高效的狐尾藻转基因方法，填补了狐尾藻转基因历史的空白，为以后科研工作者的研究奠定了基础。通过此方法可进一步改善狐尾藻的营养品质及产量等，提高了狐尾藻作为青贮饲料的价值。